針刺對血管性癡呆大鼠血清TNF－α、IL－1β及學習記憶能力的影響*

陳英華，孫忠人，金 弘，洪 霞，姜 磊，秦瑞奇，魏 巍，倪國忠

(1．黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江哈爾濱150040;2．黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱150040)

血管性癡呆(Vascular dementia，VD)是指因腦血管病導致的癡呆臨床綜合征，以反復發生缺血性卒中事件后出現癡呆、認知功能突然減退或波動樣、階梯樣進展為特點［1］，其患病率大約占腦卒中幸存者中的1/3［2］。病程中同時存在與癡呆有關的腦血管性損害表現，如局灶性體征和癥狀。該病最終導致患者的日常生活能力減退和社會活動能力逐漸喪失，嚴重影響著患者的生活質量，給患者及家庭、社會帶來沉重負擔［3－4］。目前尚無 VD滿意的治療藥物和方法。VD的防治一直是醫學界研究的熱點問題。大量研究［5－7］表明，針刺療法能夠改善癡呆患者的記憶和生活能力。本研究在導師孫忠人教授的指導下，選擇與學習記憶能力有內在聯系的相關因子為切入點，采用四血管阻斷法(4－VO)制作VD大鼠模型后，選取四神聰、風池穴進行針刺，觀察VD大鼠的學習記憶能力及檢測大鼠血清中TNF－α、IL－1β含量的變化，旨在探討針刺防治血管性癡呆的作用機制，為針刺防治VD提供進一步的理論和實驗依據。

1 材料與方法

1．1 實驗材料

1．1．1 動物 選用健康 SD雄性大鼠168只，2～3個月齡，體重(220±30)g，由黑龍江中醫藥大學實驗動物中心提供。將大鼠放入Morris水迷宮中進行定位航行、空間探索學習訓練，連續進行5天，第6天進行大鼠行為學檢測，選擇90 s內找到平臺的大鼠備用，進行水迷宮測試的168只大鼠全部符合條件。

1．1．2 儀器 電子天平(PL602－L)，梅特勒 －托利多儀器(上海)有限公司;大鼠腦立體定位儀SN－2，日本;Morris水迷宮(直徑150 cm，高60 cm;站臺規格:直徑12 cm，高25 cm)，中國醫學科學院藥物研究所;單極微手術電凝器(CHR)，武漢春光醫療美容儀器有限公司;自動平衡微型離心機(LD24－0．8)，北京醫用離心機制造廠;電動玻璃勻漿機(DY89 1型，寧波);分析振蕩器(FZQ 2型，江蘇);脈沖電療儀(KWD－808Ⅰ)，常州市武進長城醫療器械有限公司;攝像機(HDR－PJ200)，日本索尼公司;0．30 mm×13 mm“華佗牌”一次性針灸針，蘇州醫療用品廠有限公司;Ht2型酶標儀和洗板機，奧地利博塞。

1．1．3 試劑 IL－1β、TNF－α 酶聯免疫試劑盒，購自武漢博士德生物工程有限公司。

1．2 實驗方法

1．2．1 動物分組 將168只大鼠隨機分為正常組24只、假手術組24只，剩余的120只作為備用采用國際公認的Pulsinelli四血管阻斷法(4－VO)制作VD大鼠模型。其中造模期間死亡48只，存活72只。將模型制作成功大鼠72只隨機分為模型組、手針組、電針組，每組24只。共計5大組，每組分別于造模后7天、14天、21天又分為3個時間點，每個時間點各觀察8只。

1．2．1 VD模型的建立 采用國際公認的Pulsinelli四血管阻斷法(4－VO)制作 VD大鼠模型［8］。術前12 h禁食、禁水。以10%水合氯醛(0．4 ml/100 g)腹腔注射麻醉后，將大鼠伏臥固定于固定臺上，消毒，行背側頸正中切口，逐層鈍性分離暴露雙側第1頸椎橫突翼小孔，用直徑為0．5 mm的電凝針插入每側翼小孔燒灼雙側的椎動脈，造成永久性閉塞。在手術部位施以適量青霉素抗感染。24 h后再將大鼠麻醉，仰臥固定，消毒，行腹側頸正中切口，鈍性分離雙側頸總動脈，以“4”號絲線穿線牽拉頸總動脈，用微動脈夾夾閉雙側頸總動脈5 min，共夾閉3次，每次間隔1 h。術后手術部位施以適量青霉素對抗感染，然后縫合，常規飼養觀察，每天每只肌肉注射青霉素8萬U，連續7天，以防感染。

1．2．2 干預方法 ①正常組:不造模，不針刺。②假手術組:背側頸正中切口，分離雙側椎動脈，不阻斷血流;頸正中切口，分離雙側頸總動脈，不夾閉血管;抗炎后直接縫合，不針刺。③模型組:只造模，不針刺。④手針組:造模7天后即開始針刺，腧穴選取參照《實驗針灸學》［9］取左右神聰、雙側風池穴。操作方法:用0．30 mm×13 mm華佗牌毫針針刺左右神聰穴，平刺2．5 mm，雙側風池穴，向后下方斜刺5 mm，持續捻轉5 min后留針，針刺治療每日1次，每次30 min。分別于治療7天、14天、21天后3個時間點進行行為學及各觀察指標測試。⑤電針組:造模7天后即開始針刺，選取左右神聰、雙側風池穴。具體方法:用0．30 mm× 13 mm華佗牌毫針針刺左右神聰穴，向百會平刺2．5 mm，雙側風池穴，向后下方斜刺5 mm，然后連接長城牌KWD－808Ⅰ型脈沖電療儀，分別連接同側的神聰穴、風池穴，正極在上，負極在下，施以連續波，電壓2 V，頻率為2 Hz，電流100 μA，強度以肢體微顫為度，針刺治療每日1次，每次30 min。

1．2．3 行為學檢測 通過Morris水迷宮檢測大鼠的行為學習記憶能力。Morris水迷宮由圓形不銹鋼的水池、平臺、自動記錄系統、供水系統四部分組成，水池直徑150 cm，高60 cm，水深26 cm，水溫保持在(24±1)℃，池壁標明4個等距離入水點，為試驗起始點，由此將水池等分為4個象限，任選其中1個象限，正中放置1個直徑12 cm、高25 cm的平臺，迷宮上方裝有攝像機，并和錄像機以及計算機顯示器連接，自動錄入大鼠游泳軌跡進行分析。實驗時以水面稍微漫過平臺1 cm為宜。通過初篩，進行水迷宮測試的168只大鼠全部符合條件。并分別于造模前、造模后7天、針刺治療第7天、第14天、第21天的時間點進行行為學測試。

1．2．4 大鼠血清TNF－α、IL－1β 含量測定 分別于針刺治療第7天、第14天、第21天的3個時間點結束進行水迷宮測試完畢后，經心臟取血，靜置2 h，2500轉/min離心10 min，分離血清，置－20℃冰箱中備檢。采用酶聯免疫吸附法(Elise)進行IL－1β、TNF－α測定，操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

1．2．5 統計學方法 應用SPSS18．0軟件包進行統計分析，所有數據以xˉ±s表示。同一組內不同時間點采用單因素方差分析，不同組之間同一時間點比較采用t檢驗，P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2．1 水迷宮實驗結果

2．1．1 造模前后定位航行試驗 造模前、后各組大鼠逃避潛伏期的比較，見表1。

表1 造模前、后各組大鼠逃避潛伏期的比較(ˉ±s，單位:s)

表1 造模前、后各組大鼠逃避潛伏期的比較(ˉ±s，單位:s)

組別 n 造模前 造模后正常組24 29．37 ±9．88 29．67 ±8．72假手術組 24 29．62 ±9．36 30．84 ±9．52模型組 24 29．09 ±9．99 42．54 ±6．11手針組 24 29．75 ±9．27 43．90 ±7．24電針組24 29．32 ±9．64 42．83 ±8．28

由表1可以看出，造模前各組大鼠定位航行試驗逃避潛伏期無統計學差異(P＞0．05)，且有可比性;造模后模型組、手針組、電針組大鼠與正常組、假手術組對比逃避潛伏期明顯延長，差異有顯著性意義(P＜0.01)，說明VD大鼠造模成功。

2．1．2 造模前后空間探索試驗 造模前、后各組大鼠穿越平臺次數的比較，見表2。

表2 造模前、后各組大鼠穿越平臺次數的比較(ˉ±s，單位:次)

表2 造模前、后各組大鼠穿越平臺次數的比較(ˉ±s，單位:次)

組別 n 造模前 造模后正常組24 5．21 ±0．83 5．13 ±0．90假手術組 24 5．21 ±1．02 4．67 ±0．64模型組 24 5．17 ±1．20 2．50 ±0．59手針組 24 5．17 ±0．92 2．50 ±0．59電針組24 5．17 ±0．82 2．63 ±0．77

由表2可以看出，造模前各組大鼠空間探索試驗穿越平臺次數無統計學差異(P＞0．05)，且有可比性;造模后模型組、手針組、電針組大鼠與正常組、假手術組對比穿越平臺次數明顯減少，差異有顯著性意義(P＜0．01)，說明VD大鼠造模成功。

2．1．3 治療后各組大鼠不同時間點逃避潛伏期比較見表3。

表3 治療后各組大鼠不同時間點逃避潛伏期比較(±s，單位:s)

表3 治療后各組大鼠不同時間點逃避潛伏期比較(±s，單位:s)

注:與正常組比較，*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01;與假手術組比較，★P ＜0．05，★★P ＜0．01;與模型組比較，▲P ＜0．05，▲▲P ＜0．01。

組別 n 7天 14天 21天正常組 8 28．93 ±9．10▲▲ 29．95 ±10．25▲▲ 31．54 ±8．62▲▲假手術組 8 30．00 ±9．98▲▲ 31．05 ±8．79▲▲ 31．47 ±10．96▲▲模型組 8 46．11 ±10．45＊＊★★54．01 ±13．21＊＊★★ 73．97 ±8．66＊＊★★手針組 8 40．56 ±8．30＊＊★ 38．22 ±4．60▲▲ 35．88 ±4．04▲▲電針組 8 38．30 ±4．70* 35．03 ±4．03▲▲ 30．65 ±3．70▲▲

由表3可以看出，針刺治療后，與同一時間點的模型組相比，手針組、電針組大鼠逃避潛伏期明顯縮短，差異有顯著性意義(P＜0．01);同一時間點，電針組較手針組的逃避潛伏期明顯縮短，差異無統計學意義(P＞0．05)。說明針刺可以改善VD大鼠的學習記憶成績，電針組顯著。

2．1．4 治療后各組VD大鼠不同時間點穿越平臺次數的變化比較 見表4。

表4 治療后各組VD大鼠不同時間點穿越平臺次數的變化比較(ˉx±s，單位:次)

由表4可以看出，針刺治療后，與同一時間點的模型組相比，手針組、電針組大鼠穿越平臺次數明顯增 多，差異有顯著性意義(P＜0．05或P＜0．01);與同一時間點的手針組相比，電針組大鼠的穿越平臺次數明顯增多，差異有顯著性意義(P＜0．05)。說明針刺可以改善VD大鼠的學習記憶成績，電針組更為顯著。

2．2 治療后各組大鼠不同時間點血清TNF－α、IL－1β含量變化比較

表5 治療后各組大鼠血清TNF－α含量變化(ˉ±s，n=8，單位:ng/L)

表5 治療后各組大鼠血清TNF－α含量變化(ˉ±s，n=8，單位:ng/L)

注:與正常組比較，*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01;與假手術組比較，★P ＜0．05，★★P ＜0．01;與模型組比較，▲P ＜0．05，▲▲P ＜0．01。

組別 7天 14天 21天正常組 16．77±1．65▲▲ 16．77 ±1．65▲▲ 16．77±1．65▲▲假手術組18．20 ±2．76▲▲ 18．45 ±2．37▲▲ 18．39 ±2．36▲▲模型組 31．43 ±3．21＊＊★★ 34．05 ±4．54＊＊★★ 42．36 ±3．74＊＊★★手針組 22．89±3．26＊＊★★▲▲23．85 ±2．46＊＊★★▲▲22．94±3．44＊＊★★▲▲電針組 20．99 ±2．56＊＊★▲▲ 20．88 ±3．26＊＊▲▲ 22．92 ±3．76＊＊★★▲▲

由表5可以看出，針刺治療后，同一時間點的手針組、電針組大鼠血清TNF－α含量明顯下降，與模型組相比較，差異有顯著性意義(P＜0．01)。說明針刺可以降低VD大鼠的TNF－α含量，電針組較顯著。

表6 治療后各組大鼠不同時間點血清IL－1β含量變化(ˉx±s，n=8，單位:ng/L)

由表6可以看出，針刺治療后，同一時間點的手針組、電針組大鼠血清IL－1β含量顯著降低，與模型組相比較，差異有顯著性意義(P＜0.01)，說明針刺可以降低VD大鼠的IL－1β含量，電針組較顯著。

3 討論

由于大鼠的腦血管分布與人類酷似，國內外常采用SD大鼠或Wistar大鼠，利用二血管阻斷法(2－VO)、三血管阻斷法(3－VO)或四血管阻斷法(4－VO)建立VD動物模型。雖然4－VO手術較復雜，在預實驗中4－VO死亡機率較高，但實驗操作的熟練程度直接影響實驗結果［10］。由于4－VO為目前國際公認的VD造模方法，它可高度模擬VD的發病特點，且缺血后生理指標穩定，不影響缺血后結果，病理改變較為充分、明確，無明顯肢體運動障礙，病理損傷接近人急性腦缺血的變化。通過行為學檢查驗證，造模后大鼠可以達到VD模型的標準。因此，筆者采用四血管阻斷法(4－VO)建立VD動物模型。

血管性癡呆屬中醫學的“癡呆”、“呆病”、“神志病”等范疇。經云:“頭者，精明之府也”，“腦為髓海”、“腦為元神之府”，“頭者，諸陽之會，上丹于泥宮，百神所聚”。《醫學心悟》有“腎主智，腎虛則智不足”之說。這些說明神明智能與腦、腎有關。本病病因病機是腎虛髓虧、痰瘀閉阻腦絡，屬本虛標實之證，而出現智能衰退及情志異常等表現。針灸治療VD有一定的療效［10］。本研究是在傳統中醫學理論及現代醫學理論的指導下，結合導師多年的臨床經驗完成的，運用電針刺激四神聰和風池穴治療VD。四神聰為百會穴前后左右各一寸處，屬經外奇穴，同為各經脈之氣會聚之處，功如其名，針之能調節陰陽，有寧心安神、明目聰耳、醒腦益智的功效。《太平圣惠方》云:“神聰四穴，理頭風目眩，狂亂瘋癲癇，針入三分。”風池具有平肝熄風、清頭明目、醒腦安神作用，為治風之要穴。風池穴首載于《靈樞·熱病》，屬足少陽膽經穴位，膽主決斷，在精神思維活動中具有判斷事物做出決定的作用。已經研究表明，風池穴治療中風療效肯定。本組研究所選風池穴可以通過改善椎－基底動脈系統而改善腦部血液循環，改善腦的代謝，間接抑制癡呆的發展，維持殘存的腦功能。四神聰穴可以活化大腦皮質細胞，改善腦功能，減輕因癡呆而產生的各種癥狀。兩穴通電后患者有頭清目明、精力充沛之感。其機制可能是脈沖電流通過上行網狀激活系統使大腦細胞得到活化，皮質的興奮性增高;同時，基底動脈供血增多，使腦血流量增多，從而思維活躍［11］。

隨著分子生物學、分子免疫學的深入發展，炎癥反應機制在腦缺血中的作用越來越受到重視。大量證據表明，腦缺血后的炎癥反應與缺血后的繼發性腦損傷密切相關。腦組織缺血后伴隨著一系列的炎癥反應，而VD主要與缺血性腦血管病有關。腦缺血后以IL－1β和TNF－α為代表的炎性細胞因子參與了機體免疫應答和炎癥反應，且在發病后數天至1周內占主導作用。無論是炎性細胞因子過度表達，還是其誘發的其它活性物質的過度表達，都將使反應向不利于機體的方向發展。這些炎性細胞在健康成人體內含量很低，腦缺血后體內IL－1β和TNF－α的表達迅速增加，啟動多種細胞因子級聯反應，通過多種途徑損傷神經元功能，可誘導細胞凋亡。實驗證明，若用IL－1抗體、TNF－α抗體進行干預，腦缺血病灶可以縮小，促進神經功能恢復。

本研究發現造模后大鼠表現明顯的學習記憶障礙，針刺治療后可以縮短VD大鼠逃避潛伏期、增加VD大鼠穿越平臺次數。TNF－α、IL－1β在VD大鼠 血清中的表達均較正常組增高，針刺治療后顯著降低，表明針刺對VD的腦保護作用是通過抑制VD大鼠腦內炎癥這一途徑實現的。

總之，針刺四神聰、風池后能縮短VD大鼠水迷宮逃避潛伏期、增加VD大鼠水迷宮穿越平臺次數以及降低VD大鼠血清TNF－α、IL－1β的含量，抑制缺血所致的炎性細胞因子釋放，減輕神經細胞的炎性損傷，從而改善VD大鼠學習記憶能力，并且電針更為顯著，為臨床針刺治療VD提供一定的理論和實驗依據。

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