軟脂酸抑制C2C12肌細胞PGC-1α的表達

牛尚梅 馬慧娟 劉晶 高哲 李彩英 馬博清

游離脂肪酸(FFA)水平升高在肥胖、胰島素抵抗和2型糖尿病中發揮重要作用［1］。不同類型脂肪酸與胰島素敏感性關系不盡相同，其中長鏈飽和與不飽和脂肪酸與胰島素抵抗(IR)關系密切。實驗表明給予大鼠高飽和脂肪酸飲食可以導致大鼠IR［2］，具體機制尚不十分清楚，可能與骨骼肌過氧化物酶體增生物激活受體γ共激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptorγ coactivator 1α，PGC-1α)的轉錄調控有關。PGC-1α是一種核轉錄共激活因子，其在線粒體功能和IR中的作用成為近年來研究的熱點。動物研究發現Zucker糖尿病肥胖大鼠骨骼肌PGC-1α表達下調［3］。高脂與PGC-1α表達，IR關系密切。本研究擬采用不同類型長鏈脂肪酸培養C2C12肌細胞，探討脂肪酸類型及濃度對骨骼肌PGC-1α表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 實驗用脂肪酸購自Sigma公司，C2C12細胞株購自北京協和細胞庫。目的引物由上海生物工程公司合成，β-actin 上游引物:5’-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3’，下游引物:5’-TCC ACCACCCTGTTGCTGTA-3’;PGC-1α 上游引物5’-TCAGTCCTCACTGGTGGACA-3’，下游引物 3’-TGCTTCGTCGTCAAAAACAG-3’。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養與傳代:C2C12肌細胞貼壁生長于含20%小牛血清、0.6/L谷氨酞胺，6.672/LHEPES，100 U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素的RPMI1640中，于37℃，5%CO2孵箱培養。以1X106/培養瓶傳代細胞，3天后分別予 0 mmol/L、0.25 mmol/L、0.5 mmol/L、0.75 mmol/L 軟脂酸、硬脂酸、棕櫚酸、油酸和亞油酸處理細胞，持續24 h孵育。

1.2.2 試驗分組:對照組(Con)，軟脂酸組(C16∶0)、硬脂酸組(C18∶0)、棕櫚酸(C16∶1)組、油酸組(C18∶1)以及亞油酸組(C18∶2)，均分別采用0.25、0.5和0.75 mmol/L三個濃度孵育C2C12細胞。

1.2.3 熒光定量PCR分析:取RNA溶液4μl，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，明顯可見28S、18S條帶，且28S為18S條帶的兩倍，5S條帶較弱，且彌散，表明RNA降解較少，完整性良好。用756型紫外分光光度計分別測定 OD260與 OD280，選用OD260/OD280比值為1.8～2.0的RNA用作反轉錄。PCR熱循環參數:96℃ 4min，然后三步反應:94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃30 s，進行40個循環，于每個循環的第三步72℃ 30 s收集熒光信號。擴增完畢后，進入結果分析界面，以β-actin為內參照基因，與對照組相比，得到目的基因表達的相對定量值(RQ值)，將RQ值用于統計分析。

1.3 統計學分析應用SPSS13.0軟件統計，計量資料以±s表示，多個樣本均數比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度脂肪酸對肌細胞PGC-1αmRNA表達的影響在脂肪酸濃度為0.25 mmol/L時，軟脂酸組(C16∶0)、硬脂酸組(C18∶0)、棕櫚酸組(C16∶1)、油酸組(C18∶1)以及亞油酸組(C18∶2)的PGC-1αmRNA表達與對照組比較均無統計學意義(P ＞0.05)。見表1。

在脂肪酸濃度為0.5 mmol/L和0.75 mmol/L時，軟脂酸組PGC-1αmRNA表達較對照組降低(P＜0.05);棕櫚酸組、油酸組、亞油酸組PGC-1αmRNA表達與對照組和軟脂酸組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。見表1。

2.2 軟脂酸孵育時間對PGC-1αmRNA表達的影響 軟脂酸培養的肌細胞，在1 h，PGC-1αmRNA表達較0 h差異無統計學意義(P ＞0.05)，在培養6 h、12 h、24 h PGC-1α mRNA 表達較0 h。1 h降低，而24 h降低最明顯，差異有統計學意義(P＜0.01)。見表2。

表1 不同濃度脂肪酸孵育后PGC-1αmRNA表達變化比較

表1 不同時間脂肪酸孵育后PGC-1αmRNA表達變化比較

3 討論

FFA水平升高可能導致肌內脂質堆積，從而產生IR，具體機制尚不十分清楚，可能與骨骼肌PGC-1α的轉錄調控有關。血中FFA是由不同長度和飽和度的脂肪酸組成，根據碳鏈的不同分為短鏈(2～4)、中鏈(6～8)和長鏈(10～24)，根據有無雙鍵分為飽和與不飽和脂肪酸。不同類型脂肪酸與胰島素敏感性關系不盡相同，其中長鏈飽和與不飽和脂肪酸與胰島素抵抗關系密切。胰島素抵抗者骨骼肌甘油三酯以飽和脂肪酸增加為主，并且與胰島素抵抗有直接關系［4］。骨骼肌PGC-1α表達下降使線粒體氧化葡萄糖和脂肪酸能力降低，過多脂質在相應組織骨骼肌堆積，導致胰島素抵抗［5］。研究發現給正常人輸入脂肪酸混合劑24小時降低了肌肉PGC-α和氧化磷酸化基因的表達［6］，通過慢性運動可以改變PGC-1α的表達，改善胰島素敏感性［7］。體外實驗證實軟脂酸可以誘導骨骼肌細胞 IR，而油酸可以逆轉這一作用［8］，軟脂酸亦可以誘導3T3-L1脂肪細胞胰島素抵抗，其機制可能與激活JNK通路有關［9］。本研究發現飽和脂肪酸，軟脂酸孵育的C2C12肌細胞PGC-1α的表達下降，這與Crunkhorn等［10］的研究結果一致。而不飽和脂肪酸，棕櫚酸組、油酸組、亞油酸組培養的肌細胞PGC-1α的表達較對照組無明顯變化。說明脂肪酸誘導的PGC-1α的下降依賴于他們的結構或特殊的氧化產物。

Coll等［11］研究了不同時間軟脂酸對骨骼肌細胞PGC-1α表達的作用，發現1 h無變化，4 h(2倍，有意義)和8 h(1.5倍，有意義)輕度變化，較大下降在16 h后，16 h后表達下降55%。本研究顯示軟脂酸對PGC-1α的抑制作用出現在6 h，24 h抑制作用最強，與上述結果類似，說明飽和脂肪酸對PGC-1α的抑制作用有時間依賴性，可能與底物的作用或氧化增加有關。本研究采用250、500、700μmol/L三個濃度，在低濃度(250μmol/L)PGC-α表達無明顯變化，但在500μmol/L即出現PGC-1α表達下降，700μmol/L濃度時更明顯。已知在肥胖和2型糖尿病者血漿 FFA升高，一般都超過 500μmol/L，而本研究在500μmol/L已經出現 PGC-1α表達下降，分析可能是血漿中FFA是不同類型脂肪酸的總合，包括長鏈、短鏈、飽和以及不飽和。所以單純一種脂肪酸來說500μmol/L的濃度已經是比較高的劑量，從而影響了PGC-α的表達，而且這種影響與脂肪酸濃度有關。

軟脂酸誘導的PGC-1α表達下降可同時伴有許多三羧酸循環和氧化磷酸化基因的下降，基因敲出小鼠PGC-1α表達下降使線粒體基因表達和骨骼肌數量降低［13］。所以軟脂酸誘導的PGC-1表達下降，可能導致線粒體功能異常，并且這種異常與胰島素抵抗有關，但具體的作用機制仍然不清楚，需要進一步的研究。

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