幽門螺桿菌感染對胃黏膜組織TGF-βRI表達的影響

高文娟

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，H.pylori)感染是慢性胃炎的主要病因，已被世界衛生組織列為胃癌的Ⅰ類致癌危險因素［1］。胃癌的發生是一個多階段漸進的過程，H.pylori在正常胃黏膜向癌前病變和胃癌轉化過程中對細胞生長的影響如何尚不明確。轉化生長因子 β(transforming growth factor beta，TGF-β)是重要的細胞生長調控成分，與腫瘤的發生關系密切。我們先前的研究已發現，在慢性淺表性胃炎(chronic superficial gastritis，CSG)組織和重度腸化生(intestinal metaplasia，IM)胃黏膜組織中，H.pylori感染與TGF-β1表達的上調有關，而胃黏膜中重度不典型增生(dysplasia，Dys)組織及胃腺癌(gastric adenocarcinoma，GAC)組織中則沒有發現這種相關性，提示H.pylori對TGF-β1的影響可能主要作用于胃癌發生的早期［2］。在此基礎上，我們認為研究H.pylori相關性胃炎及伴有癌前病變的胃黏膜對了解H.pylori與TGF-β1的關系更為重要。TGF-β受體是介導TGF-β作用的關鍵結構，有關H.pylori感染與TGF-βRI表達水平的關系尚未受到重視。本文采用H.pylori快速尿素酶試驗(HpRUT)、PCR-Hp-16SrRNA檢測和14C-尿素呼氣試驗(14C-UBT)同步檢測CSG、重度IM和中重度Dys組織中H.pylori感染情況，并以免疫組化方法分別檢測其中TGF-βRI的表達，探討H.pylori感染對TGF-βRI表達的影響及對胃癌發生過程的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院2008年2月至2009年4月間胃鏡活檢標本，篩選108例進入研究。其中CSG49例(CSG組，H.pylori陰性的輕度CSG 16例;H.pylori相關性CSG 33例)，重度IM 39例(IM組)，中重度不典型增生20例(Dys組)(中度13例，重度7例)。所有標本在胃竇距幽門3 cm以內取2塊胃黏膜組織，1塊即行HpRUT，1塊-7℃保存，備PCR檢測。另各取病灶胃黏膜組織2塊，100 ml/L中性甲醛固定，常規石蠟包埋，連續切片，片厚5μm。

1.2 方法

1.2.1 H.pylori檢測

1.2.1.1 Hp-RUT:采用HpUT-H104試劑盒(分析化學法，福建三強生化有限公司)，5 min以內呈黃至棕黃色為陽性，不變色為陰性。

1.2.1.2 PCR-Hp-16SrRNA檢測:采用PE9600PCR儀(Perkin-Elmer公司)，PCR-Hp-16SrRNA 引物序列 CP-1:5’-GCG CAA TCA GCG TCA GGT AAT G-3’，CP-2:5’-GCT AAG AGA TCA GCCTAT GTCC-3’，擴增片段500 bp，產物2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外透射儀下呈與陽性對照相同位置的明顯條帶為陽性。

1.2.1.3 14C-UBT:患者在檢查前4周內未服用抗H.pylori藥物，以100 dpm/mmol CO2為診斷閾值，大于診斷閾值判為H.pylori陽性。

1.2.2 H.pylori診斷標準:Hp-RUT、PCR-Hp-DNA和14C-UBT 3項檢測中2項以上陽性者判為H.pylori陽性;均陰性判為H.pylori陰性，僅1項陽性者未進入本研究。

1.2.3 免疫組化染色結果判斷:按A:無染色為0分，細胞膜或漿內見淡黃色顆粒、明顯高于背景為1分，較多棕黃色顆粒為2分，大量深棕黃色顆粒為3分;B:每片隨機觀察5個視野，計數500個細胞中染色陽性細胞數，陽性細胞數＜30%為1分，31%～75%2分，＞76%為3分。A×B得0者為-，1～4分為+，4分以上++。

1.2.4 TGF-βRI檢測:采用免疫組化 SP 法，即用型 TGF-βRI抗體及SP試劑盒，PBS代替一抗為陰性對照，室溫下操作:①切片脫蠟至水;②每步用PBS工作液洗3次，每次3 min;③過氧化酶阻斷劑10 min;④10%非免疫血清孵育10 min;⑤第一抗體孵育60 min;⑥生物素標記的第二抗體孵育10 min;⑦鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶孵育10 min;⑧DAB顯色;⑨蘇木素復染、中性樹膠封固。

1.3 統計學分析 應用SPSS 10.0統計軟件，計數資料采用χ2檢驗、spearman等級相關分析及Kolmogorov-Smirnov檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 H.pylori感染情況 CSG組67.35%(33/49)H.pylori陽性，IM組為82.05%(32/39)，Dys組為60%(12/20)。其中中度Dys組為53.85%(7/13)，重度 Dys組為71.43%(5/7)。3組H.pylori陽性率無顯著性差異(χ2=3.825，P=0.148)。見表1。

表1 3組H.pylori感染情況 例

2.2 TGF-βRⅠ表達與H.pylori感染 TGF-βRⅠ陽性反應產物呈深棕色，分布于胞膜及胞質。等級相關分析發現，從CSG、IM到中度、重度Dys組，各組中H.pylori陽性者TGF-βRI的表達與病變的嚴重程度呈負相關(r=-0.707，P＜0.01)，隨黏膜病變程度的加重，TGF-βRI表達呈減少趨勢;而各組中H.pylori陰性者無1例TGF-βRI表達缺失，Kolmogorov-Smirnov檢驗示4組H.pylori陰性者TGF-βRI表達無顯著差異(Kolmogorov-Smirnov Z=1.162，P=0.134)。見表2、3。

表2 4組中H.pylori陽性者TGF-βRI表達情況 例

表3 4組中Hp陰性者TGF-βRI表達情況 例

3 討論

目前公認H.pylori持續感染可引起慢性胃炎，進而引起胃黏膜細胞代謝改變，阻斷胃液中抗壞血酸的主動分泌機制，當H.pylori感染慢性胃炎發展至萎縮和腸化時，胃酸分泌減少，胃內pH升高，不但降低了胃中和環境致癌原的能力，而且有利于細菌繁殖，并促進N-亞硝基化合物的形成，從而有利于胃癌的發生。在這一過程中，H.pylori對胃黏膜上皮細胞增殖調控的影響機制十分復雜。我們的研究曾經發現，H.pylori陽性的IM及Dys胃黏膜組織中，PCNA高表達者顯著多于H.pylori陰性組，提示H.pylori感染確可增加胃黏膜細胞的增殖，同時發現在GAC組中PCNA的表達與H.pylori的感染情況無關，這可能提示H.pylori主要作用于胃癌發生的早期［3］。

TGF-β家族是一類多功能的細胞因子，哺乳動物表達其中的 TGF-β1，2，3。TGF-β 家族有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型受體，其中Ⅲ型受體不直接傳遞信號，TGF-β的信號是通過Ⅰ、Ⅱ型受體與TGF-β配體形成復合物，活化Ⅰ型受體的STK激酶而傳遞到胞內。TGF-β及其受體的功能是影響細胞生長調控的重要因素，參與了胃癌的發生［4］。我們率先對H.pylori與TGF-β1表達進行的研究發現，H.pylori感染可上調胃黏膜TGF-β1的表達，但這一作用主要出現在癌前病變組織［2］。于TGF-β1的表達存在反饋調節機制，TGF-β1的高表達可能與組織獲得產生TGF-β1的能力有關。作為致癌危險因子的H.pylori感染是否通過影響TGF-β受體在胃黏膜癌前病變的表達進而影響胃癌的發生，應是了解H.pylori在胃癌發生過程中作用的一個重要內容。本研究中我們發現，在H.pylori陽性的病例，從CSG、IM到中度、重度Dys組，隨黏膜病變程度的加重，TGF-βRI表達呈減少趨勢，病變程度與TGF-βRI表達之間呈負相關關系，H.pylori感染明顯下調了TGF-βRI的表達，這種情況下，高水平的TGF-β1可能對自身無抑制效應，但可抑制周圍組織的增殖和淋巴細胞的免疫作用，從而有利于腫瘤的生長。大量的TGF-β1一方面可減輕機體產生的炎性反應，另一方面可能通過抑制TH1型和增強TH2型的免疫應答調低免疫反應，導致H.pylori感染慢性化［5］。H.pylori持續感染不但可誘導有絲分裂，且慢性炎癥過程中DNA鏈斷裂和染色體損傷的積累，有利于內源性突變發生［6］。與此同時，我們發現各組中H.pylori陰性者無1例TGF-βRⅠ表達缺失，且其TGF-βRI表達無顯著差異。因此我們認為，H.pylori感染可能是誘發胃黏膜癌前病變組織TGF-βRⅠ表達缺失，進而逃避TGF-β1誘導的細胞凋亡，喪失胃黏膜高增殖狀態下DNA復制的精密性，從而向癌變演化過程的又一個重要影響因素。

1 朱亞杰，邱萌，周繼陶，等.胃癌中 P53蛋白轉錄調控活性的分析及其臨床意義.中華醫學遺傳雜志，2010，27:60-65.

2 Gu YM，Ma YH，Zhao WG，et al.Dickkopf3 overexpressioninhibits pancreatic cancer cell growth in vitro.World JGastroenterol，2011，17:3810-3817.

3 Tsai KW，Wu CW，Hu LY，et al.Epigenetic regulation of miR-34b and miR-129 expression in gastric cancer.Int J Cancer，2011，129:2600-2610.

4 Ding WJ，Fang JY，Chen XY，et al.The expression and clinicalsignificance of DNA methyltransferase proteins in human gastriccancer.Dig Dis Sci，2008，53:2083-2089.

5 Yokobori T，Mimori K，Iwatsuki M，et al.p53-Altered FBXW7 expression determines poor prognosis in gastric Cancer cases.Cancer Res，2009，69:3788-3794.

6 Sirak I，Petera J，Hatlova J，et al.Expression of p53，p21 and p16 does not correlate with responseto preoperative chemoradiation in gastric carcinom.Hepatogastroenterology，2009，56:1213-1218.