戊己丸不同配伍方對(duì)結(jié)腸平滑肌細(xì)胞5-HT 3，4受體及下游信號(hào)傳導(dǎo)通路主要元件的影響*

王迎寒，周淑媛，鞏仔鵬，楊 慶，王婭杰，朱曉新△

(1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100700;2.承德醫(yī)學(xué)院，河北承德 067000)

戊己丸源于《太平惠民和濟(jì)局方》，由黃連、吳茱萸和白芍組成。其中黃連為君，味苦性寒，善清火燥濕;白芍味酸甘，入肝經(jīng)，可柔肝緩急、健脾益氣，為臣;吳茱萸辛熱，溫中健脾開(kāi)郁并引熱下行，三藥合用共奏疏肝理脾、健脾和胃之功，符合中醫(yī)治療脾胃病以“健脾祛濕以運(yùn)中焦、調(diào)肝理氣以暢氣機(jī)”的治療大法［1］，為治療肝脾不和所致腹痛泄瀉的常用方劑，臨床中常用于治療胃腸道炎癥及腸易激綜合征(IBS)。胃腸動(dòng)力障礙是IBS的主要病理生理之一，至今仍備受關(guān)注。隨著科研方法和研究手段的不斷進(jìn)步，對(duì)于胃腸運(yùn)動(dòng)的研究已經(jīng)從在體運(yùn)動(dòng)和離體肌電、肌動(dòng)的宏觀水平深入到單個(gè)細(xì)胞、細(xì)胞器甚至分子水平。平滑肌細(xì)胞是胃腸運(yùn)動(dòng)的基本單位，也是研究胃腸運(yùn)動(dòng)的靶細(xì)胞。

前期實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，戊己丸不同配伍方能改善炎癥后IBS(PI-IBS)模型大鼠的結(jié)腸運(yùn)動(dòng)，其作用機(jī)制可能與參與調(diào)節(jié)結(jié)腸和中樞邊緣系統(tǒng)內(nèi)5-羥色胺(5-HT)含量，以及 5-HT 3，4受體(5-HT 3，4 R)、環(huán)磷酸腺苷(cAMP)、Ca2+含量有關(guān)。但由于在體胃腸運(yùn)動(dòng)受到諸多神經(jīng)及其遞質(zhì)的調(diào)節(jié)，機(jī)制非常復(fù)雜。因此，本實(shí)驗(yàn)擬采用分離培養(yǎng)的大鼠結(jié)腸平滑肌細(xì)胞在離體狀態(tài)下，以5-HT 3，4R為切入點(diǎn)，戊己丸不同配伍方對(duì)胃腸運(yùn)動(dòng)的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 SD雄性SPF級(jí)大鼠，體質(zhì)量250～300g，購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研究所(SCXK(京)2009-0017)。

1.1.2 試劑及儀器 (1)主要試劑:大豆胰蛋白酶抑制劑(批號(hào) T6522)、Ⅱ型膠原酶(批號(hào)C6885)、高糖 DMEM(批號(hào) 12100-046)、小牛血清(批號(hào) 00548)、HTR3A antibody(批號(hào) GTX85866)Flou 3A熒光探針(批號(hào)20071101)、α-actin(批號(hào)bs-0189R)、兔 Streptavidin-HRP試劑盒 (批號(hào)CW2035)、5-HT4 receptor antibody(批 號(hào)GTX30983)、山羊抗兔IgG(H+L)DyLight649(批號(hào)CW0232)、大鼠 cAMP酶聯(lián)免疫試劑盒(批號(hào)F15181)、大鼠 PKA酶聯(lián)免疫試劑盒(批號(hào)F16577)、HEPES Ringer緩沖液(每1L中含HEPES 5.839g，NaCl 5.902 g，KCl 0.969 g，NaH2PO40.39 g，CaCl20.2 g，MgCl20.24 g，谷胺酸鈉 0.936 g，谷胺酰胺 0.292 g，葡萄糖 2.279 g，BSA 1 g，pH 至7.2，過(guò)濾除菌);(2)主要儀器:SORVALL LEGEND RT+冷凍高速離心機(jī)(Thermo SCIENTIFIC)、CKX41倒置顯微鏡(OLYMPUS)、SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)、MCO-20AICCO2INCUBATOR(SANYOElectric CO.，Ltd)、FV1000 激 光 共 聚 焦 顯 微 鏡(OLYMPUS)、IX81 倒置顯微鏡(OLYMPUS)、ELX800型酶標(biāo)儀(BIO-TEK INSTRUMENTS，INC)。

1.1.3 藥物 苯基雙胍(B)(批號(hào)P1002)、阿洛司瓊(A)(批號(hào)sc-210788)、替加色羅(T)(批號(hào)sc-212993)、GR113808(GR)(批 號(hào) G5918)、SQ22536(SQ)(批號(hào) S153)、Forskolin(F)(批號(hào)F6886)、戊已丸提取物:黃連、制吳茱萸、炒白芍飲片購(gòu)自北京衛(wèi)仁飲片廠，并經(jīng)中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所鑒定，黃連醇提物、吳茱萸醇提物、白芍水提物由中日友好醫(yī)院劑型室按照優(yōu)選工藝分別進(jìn)行提取;將單味藥按L9(34)正交表(黃連、吳茱萸、白芍各有3個(gè)劑量水平交互配比成戊己丸9個(gè)不同配伍方)，以黃連、吳茱萸及白芍的比例分別為12∶2∶3，12∶1∶12 為受試的1 號(hào)方(W1)和2 號(hào)方(W2)［2］。

1.2 方法

1.2.1 結(jié)腸平滑肌的分離、培養(yǎng)及鑒定 參考Bitar方法［3］，每次取2只大鼠分離結(jié)腸平滑肌細(xì)胞，Trypan藍(lán)染色法檢查細(xì)胞活性，確認(rèn)活細(xì)胞在90%以上。調(diào)細(xì)胞濃度至5×105/mL接種于培養(yǎng)瓶中，37℃ 95%O2和5%CO2條件下培養(yǎng)。24 h后換液，以后每3 d更換培養(yǎng)基1次，期間用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。10d左右，細(xì)胞長(zhǎng)滿90%培養(yǎng)瓶底時(shí)按1∶3比例傳代。并取原代細(xì)胞進(jìn)行爬片，行α-actin免疫組織化學(xué)染色［4］。

1.2.2 戊己丸儲(chǔ)備液的配制 1號(hào)方提取物(黃連0.1927 g，吳茱萸0.0294 g，白芍0.02335 g)和2號(hào)方提取物(黃連0.1927 g，吳茱萸0.0147 g，白芍0.0934 g)溶于雙蒸水中，DMSO助溶，均定容至10 mL，4℃保存，臨用時(shí)用無(wú)血清的培養(yǎng)基稀釋到0.62 g/L和0.75 g/L，過(guò)濾除菌后應(yīng)用。

1.2.3 觀察指標(biāo) (1)免疫熒光法檢測(cè)大鼠結(jié)腸平滑肌細(xì)胞5-HT 3，4R:收集第2代平滑肌細(xì)胞，消化后調(diào)細(xì)胞濃度為5×105/mL，接種于預(yù)先放置蓋玻片的24孔板中爬片。2d后換新鮮培養(yǎng)基，同時(shí)加入1號(hào)方或2號(hào)方溶液和工具藥(B或A或T 或 GR，12.5μg/mL)溶液各50μL，同時(shí)設(shè)空白、工具藥及戊己丸對(duì)照孔，每孔總體積為500μL，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。免疫熒光染色主要步驟:取出細(xì)胞爬片，用PBS漂洗2次，4%多聚甲醛固定，正常山羊血清封閉;一抗孵育(5-HT3R或5-HT4R，1∶100)，4℃過(guò)夜，PBS 洗;熒光二抗(1∶100)37℃避光孵育60 min，PBS洗;蒸餾水漂洗1次封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察。每張片子隨機(jī)取3～5個(gè)視野并拍照，用軟件FV1000計(jì)算熒光強(qiáng)度;(2)激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)大鼠結(jié)腸平滑肌細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度:取第2代平滑肌細(xì)胞，消化后調(diào)細(xì)胞濃度為1×105/mL，接種于激光共聚焦專用培養(yǎng)皿中，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基2mL，于培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，貼壁后加入1號(hào)方或2號(hào)方，繼續(xù)培養(yǎng)12h，PBS洗3次，加入4μmol/L的 Fluo-3/AM 工作液，37℃培養(yǎng)20min，再加入5倍體積含1%胎牛血清的HBSS，繼續(xù)培養(yǎng)40 min，PBS洗3次，皿中留1 mL PBS待測(cè)。激光共聚焦顯微鏡下，488nm，20倍掃描成像，每個(gè)樣本掃描加入刺激劑前及加入刺激劑5 min時(shí)的圖像，比較熒光強(qiáng)度變化，以熒光強(qiáng)度表示胞內(nèi)游離鈣的水平。刺激劑分別為A、B、T和GR，終濃度均為1.25μg/mL;(3)雙抗夾心法檢測(cè)大鼠結(jié)腸平滑肌細(xì)胞內(nèi)cAMP，PKA濃度:第2代平滑肌細(xì)胞消化后，調(diào)細(xì)胞濃度為5×105/mL，接種于96孔板中，每孔20μL，補(bǔ)足新鮮培養(yǎng)基，每孔總體積為200μL，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)。2d后每孔換新鮮培養(yǎng)基180μL，同時(shí)加入1號(hào)方或2號(hào)方溶液20μL，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。再加入工具藥(T或GR或F或SQ)，使工具藥的終濃度分別為1.25μg/mL、1.25μg/mL、1 nmol/mL、0.5 nmol/mL，培養(yǎng) 0.5h。同時(shí)設(shè)空白對(duì)照、工具藥及戊己丸對(duì)照孔，每個(gè)藥物均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。培養(yǎng)結(jié)束后，棄去培養(yǎng)上清，PBS洗3次，然后每孔加入 PBS 200μL，反復(fù)凍融3次，－80℃保存。采用雙抗夾心法進(jìn)行檢測(cè)cAMP和PKA濃度。

2 結(jié)果

2.1 大鼠結(jié)腸平滑肌的培養(yǎng)及鑒定

如圖1、2所示，在培養(yǎng)10d左右，原代培養(yǎng)的大鼠結(jié)腸平滑肌細(xì)胞呈梭型，排列緊密，生長(zhǎng)狀態(tài)良好。經(jīng)α-actin免疫組化鑒定，分離培養(yǎng)的細(xì)胞胞漿內(nèi)分布大量黃色顆粒(圖4)，而陰性對(duì)照細(xì)胞胞漿內(nèi)無(wú)著色(圖3)，分離培養(yǎng)的細(xì)胞鑒定為大鼠結(jié)腸平滑肌細(xì)胞。

2.2 戊己丸不同配伍方對(duì)平滑肌細(xì)胞5-HT 3，4R 的影響

表1顯示，與NC組比較，1號(hào)方和2號(hào)方均可顯著降低5-HT3R熒光強(qiáng)度(P＜0.01)。經(jīng)A和GR處理后，5-HT 3，4R熒光強(qiáng)度明顯增高;兩方均可使其顯著下降(P＜0.05，P＜0.01)。經(jīng)B和T處理后，5-HT 3，4R熒光強(qiáng)度明顯降低，兩方均能顯著促進(jìn)其下降(P＜0.05，P＜0.01)，1號(hào)方和2號(hào)方 之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)。

圖1 培養(yǎng)10d左右的SMC(×10)

圖2 培養(yǎng)10d左右的SMC(×20)

圖3 陰性對(duì)照(×20)

圖4 SMC α-actin 組化染色(×20)

表1 平滑肌細(xì)胞5-HT 3，4R表達(dá)比較(±s)

表1 平滑肌細(xì)胞5-HT 3，4R表達(dá)比較(±s)

注:與 NC組比較:*P ＜0.05，＊＊P＜0.01;與 W1組比較:△P＜0.05，△△P ＜0.01(下同)

R組別5-HT3 5-HT4R 26 W1 935.92±108.52＊＊ 1434.61±56.07* 676.59±54.67＊＊ 1193.72±73.23＊＊ 987.47±93.99* 1544.54± 68.67＊＊W2 777.19± 76.74＊＊△ 1336.48±34.34＊＊△ 574.73±60.77＊＊△△ 1093.41±64.84＊＊△ 809.37±97.90＊＊△△ 1419.57± 84.04 GR NC 1250.77± 89.49 1596.64±99.41 802.79±45.59 1371.56±95.33 1125.51±76.22 1776.07±110.無(wú)工具藥 A B 無(wú)工具藥T＊＊△

2.3 戊己丸不同配伍方對(duì)平滑肌細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+的影響

表2顯示，1號(hào)方和2號(hào)方均可使大鼠結(jié)腸平滑肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度顯著下降(P＜0.01)。經(jīng)A和GR處理后，Ca2+濃度均顯著下降，兩方均可顯著促進(jìn)其下降(P＜0.01)。經(jīng)B和T處理后，Ca2+濃度均顯著升高，兩方均可使其明顯下降(P＜0.05，P＜0.01)，1號(hào)方和2號(hào)方之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)。

表2 平滑肌細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+比較(±s)

表2 平滑肌細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+比較(±s)

組 別 無(wú)工具藥.01±10.86 161.42±7.02 W1 151.05±6.55＊＊ 128.11±5.64＊＊ 220.31±11.72＊＊ 221.35±14.39* 142.14 ±5.80＊＊W2 136.90±4.02＊＊△ 113.56±2.39＊＊△ 198.05± 7.14＊＊△ 193.90±12.44＊＊△ 121.02 ±5.26 GR NC 181.42±8.77 150.71±8.64 254.61±12.94 260 A B T＊＊△△

2.4 戊己丸不同配伍方對(duì)平滑肌細(xì)胞內(nèi)cAMP、PKA 的影響

表3、4顯示，1號(hào)方和2號(hào)方均可使平滑肌細(xì)胞內(nèi)cAMP和PKA顯著下降(P＜0.01)。經(jīng)T和F處理后，cAMP和PKA均顯著升高，兩方均可使其明顯下降(P＜0.05，P＜0.01)。經(jīng)GR和SQ處理后，cAMP和PKA均顯著降低，兩方均可明顯促進(jìn)其下降(P＜0.05，P＜0.01);1號(hào)方和2號(hào)方之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)。

表3 平滑肌細(xì)胞內(nèi)cAMP的比較(pmol/mL，±s)

表3 平滑肌細(xì)胞內(nèi)cAMP的比較(pmol/mL，±s)

組 別 無(wú)工具藥8.17±0.46 W1 8.17±0.59＊＊ 11.50 ±0.48＊＊ 7.51±0.18＊＊ 11.56±0.30＊＊ 7.67±0.34*W2 7.31 ±0.59＊＊△ 10.22 ±0.44＊＊△△ 6.76 ±0.37＊＊△△ 9.68 ±0.64＊＊△△ 6.78 ±0.40 GR F SQ NC 9.41±0.32 13.07±0.68 8.29±0.19 13.78±0.53 T＊＊△△

表4 平滑肌細(xì)胞內(nèi)PKA的比較(pg/mL，±s)

表4 平滑肌細(xì)胞內(nèi)PKA的比較(pg/mL，±s)

組 別 無(wú)工具藥.91 15.83±1.71 W1 15.28±1.91＊＊ 37.39 ±3.37＊＊ 13.82±1.14＊＊ 33.19±2.15* 12.35±2.03＊＊W2 12.63 ±2.26＊＊△ 31.45 ±3.50＊＊△△ 11.07 ±1.54＊＊△△ 28.43 ±1.68＊＊△△ 10.07 ±1.28 GR F SQ NC 20.30±1.95 46.43±3.12 16.65±1.46 42.41±4 T＊＊△

3 討論

5-HT3受體是陽(yáng)離子通道受體，5-HT4受體是G蛋白偶聯(lián)受體，兩者均廣泛分布于胃腸道的黏膜層、肌層和腸神經(jīng)系統(tǒng)，可由5-HT激活，參與胃腸運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)。越來(lái)越多的研究表明，腸易激綜合征患者5-HT 3，4受體表達(dá)異常，是腸易激綜合征的發(fā)病機(jī)制之一。本實(shí)驗(yàn)中戊己丸不同配伍方在離體狀態(tài)下可抑制5-HT 3，4受體的表達(dá)，從而拮抗5-HT 3，4受體介導(dǎo)的胃腸運(yùn)動(dòng)加快，這可能是其改善PIIBS大鼠結(jié)腸運(yùn)動(dòng)的作用機(jī)制之一。目前的研究報(bào)道雖未查到戊己丸及其組分可下調(diào)5-HT 3，4受體表達(dá)的報(bào)道，但其作用卻是真實(shí)存在的。

Ca2+在介導(dǎo)平滑肌收縮反應(yīng)中起核心作用，其濃度的升高依賴于胞外Ca2+內(nèi)流或胞內(nèi)貯存Ca2+釋放。胞外Ca2+內(nèi)流起主要的作用，通過(guò)電壓門(mén)控鈣通道、鈣庫(kù)調(diào)控性鈣通道和受體操縱性鈣通道3種方式介導(dǎo)［5］，但起主要作用的是電壓門(mén)控鈣通道，尤其是 L-型鈣通道［6，7］。5-HT 作用于 3、4 受體后均可激活L-型電壓門(mén)控鈣通道，使平滑肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+增多。戊己丸中小檗堿作為鈣通道拮抗劑，在抑制Ca2+內(nèi)流上起重要作用;而戊己丸又可下調(diào)3、4受體的表達(dá)，使L-型電壓門(mén)控鈣通道的激活減少，Ca2+內(nèi)流亦隨之減少，從而使胞內(nèi)Ca2+濃度下降，平滑肌收縮減慢。

cAMP作為第二信使，其調(diào)控作用廣泛分布于胃腸道的黏膜層、肌層以及腸神經(jīng)系統(tǒng)中，對(duì)胃腸道的運(yùn)動(dòng)、內(nèi)臟感覺(jué)及分泌都具有非常重要的調(diào)節(jié)作用，可由AC活化而產(chǎn)生，進(jìn)一步激活PKA，影響多種蛋白的磷酸化及離子通道的激活或失活，使細(xì)胞對(duì)外界刺激產(chǎn)生反應(yīng)。5-HT4R的活化能使其增加。現(xiàn)代藥理研究表明，黃連、白芍及芍藥苷均能調(diào)節(jié)cAMP信號(hào)傳導(dǎo)通路［8～10］，說(shuō)明戊己丸下調(diào)平滑肌細(xì)胞cAMP水平可能是其改善結(jié)腸運(yùn)動(dòng)的作用機(jī)制之一。

由此我們推測(cè)，在無(wú)神經(jīng)和體液的干預(yù)下，戊己丸可以通過(guò)調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞的5-HT 3，4R及cAMP水平，影響細(xì)胞的收縮舒張運(yùn)動(dòng)，此作用可能是其改善PI-IBS大鼠結(jié)腸運(yùn)動(dòng)的作用機(jī)制之一。在本實(shí)驗(yàn)中，2號(hào)方的作用優(yōu)于1號(hào)方，其原因可能是兩方中吳萸和白芍的用量差別較大，而中藥復(fù)方療效不同于單味藥的相加，其作用隨方中用藥比例不同而有差異［11，12］。

［1］鄭耿東，何科蔚，余榕健，等.淺析當(dāng)代嶺南名老中醫(yī)辨證治療脾胃病的特點(diǎn)［J］.中醫(yī)雜志，2013，54(5):445-447.

［2］王婭杰，董宇，朱曉新.戊己丸提取物不同配伍方對(duì)豚鼠離體結(jié)腸運(yùn)動(dòng)影響的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)中藥雜志，2007，32(20):2161-2165.

［3］Bitar KN.Makltlouf GM.Receptors on smooth muscle cells:charactarization by contraction and specific antagonists［J］.Am J Physiol，1982，242:400-407.

［4］梁寧霞，衣蘭娟，田琳，等.鼠結(jié)腸平滑肌細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定［J］.江蘇醫(yī)藥，2005，31(6):433-436.

［5］Ke DP，Zhou H，Li ZW，et al.Capacitative Ca2+entry mediates contraction in rat distal colon smooth muscle［J］.ZhongguoYaoLiXueTongBao，2006，22(3):344-348.

［6］楊寶峰.離子通道藥理學(xué)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2005:155，161，172.

［7］Kinoshita K，Sato K，Hori M，et al.Decrease in activity of smooth muscle L-type Ca2+channels and its reversal by NF-kappaB inhibitors in Crohn’s colitis model［J］.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2003，285(3):G483-G493.

［8］Chang Yan，Zhang Lei，Wang Chun，et al.Paeoniflorin inhibits function of synoviocytes pretreated by rIL-1αand regulates EP4 Rreceptor expression ［J］.J Ethnopharmacol，2011，137(3):1275-1282.

［9］Jiang DaiXun，Chen YiShan，Hou XiaoTao，et al.Influence of paeonia lactiflora roots extracton cAMP-phosphodiesterase activity and related anti-inflammatory action ［J］. J Ethnopharmacol，2011，137(1):914-920.

［10］張?jiān)闯保瑢O紅勝，潘正論，等.白芍總苷在風(fēng)濕免疫病中的研究進(jìn)展［J］.世界臨床藥物，2010，31(8):449-453.

［11］張斐，杜武勛，朱明丹，等.中藥復(fù)方量效關(guān)系研究現(xiàn)狀［J］.中醫(yī)雜志，2013，54(1):74-77.

［12］宮海明，王兆淦，段文卓.戊己丸鎮(zhèn)痛、抗炎作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)中醫(yī)藥科技，1998，5(3):147-148.