慢性支氣管炎大鼠結腸損害與肺腸組織內皮素表達的相關性研究*

王寶家，楊 宇，唐洪屈，鄭秀麗，商紹東，王恩成，陳云慧

(成都中醫藥大學，成都 610075)

“肺與大腸相表里”的理論源于《黃帝內經》［1］，肺與大腸生理上相互依存，病理上相互影響，治療上相互為用。臨床可根據慢性肺疾病患者出現的證候，運用通腑法治療肺部疾病取得顯著療效［2，3］。課題組前期研究成果提示，“肺病及腸”的主要病變部位是結腸［4，5］，故本研究觀察模型大鼠肺與結腸組織形態學變化，檢測胃腸功能及肺腸組織內皮素1(ET-1)含量并進行相關性分析，以探討慢性支氣管炎大鼠結腸損害的機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 動物與分組 SPF級雄性SD大鼠60只，由成都達碩生物科技有限公司提供，體質量200±20g，隨機分為正常組24只和模型組36只。

1.1.2 主要試劑和設備 (ET-1)Elisa試劑盒(RD公司)，天下秀香煙(川渝中煙工業公司)，煙熏箱(自制紙箱，550mm×330mm×390mm，對側頂端開孔3cm×8cm)，電子秤(ACS-3H型，中山市金利電子衡器有限公司制造)，高速低溫離心機(TGL-16G型，上海科學儀器廠)，電動玻璃勻漿機(DY89-Ⅱ型，寧波新芝生物科技有限公司)，數顯恒溫水浴鍋(HHS型，江蘇正基儀器有限公司)，Thermo移液器(ZX1437型，北京艾德豪克國際技術有限公司)，ELx800吸收光酶標儀(Biotek美國伯騰儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 模型制備 參照前期研究用改良單純煙熏法造模［8］，正常組置常溫無煙室內飼養(室溫25℃～26℃，相對濕度50%～70%;模型組大鼠置于飼養籠內，用自制煙熏箱罩住，點燃香煙置于鋼絲網上，每份8支，約15min香煙燃盡后放置第二批香煙，每次共24支香煙持續煙熏50min，每天3次(9點、14點和19點)，共煙熏70d。

1.2.2 取材 在造模第20天、第50天、第70天分別隨機抽取正常組大鼠8只和模型組大鼠10只，以2.4%水合氯醛麻醉、頸椎脫臼處死，取左肺葉和結腸以10%中性甲醛固定，石蠟包埋，切片(5μm)，行HE染色;取右肺葉和結腸(各約0.2g)勻漿，3000r/min離心 20min，取上清液 1.5ml于－85℃冰箱保存。

1.2.3 胃腸功能檢測方法 ①糞便干濕重、糞便含水率:分別在造模第19、49、69天(上午9點)，收集各組大鼠24h糞便顆粒，稱重后予以記錄，將稱濕重后的糞便置于60℃遠紅外線快速恒溫干燥箱中干燥10h，稱重并予以記錄。糞便含水率(%)=(糞便濕重－糞便干重)/糞便濕重×100%;②胃內殘留率與小腸推進率:大鼠處死前禁食24h，用5%炭末與10%羧甲基纖維素鈉制成懸混液，各組大鼠以20ml·kg－1的劑量灌胃，30min 后以 2.4%水合氯醛1.2ml～1.4 ml/100g腹腔注射麻醉，取全胃沖洗后稱胃全重，清除胃內容物后稱胃空重，胃內殘留率(%)=(胃全重－胃空重)/胃全重×100%。打開大鼠腹腔分離腸系膜，剪取幽門至回盲部的腸管，不加牽引平鋪于玻璃板上，測其全長和炭末前沿至幽門的距離，計算其與全長的百分比，即推進百分率、小腸推進率(%)=(炭末推進距離)/小腸全長×100%。

1.2.4 組織ET-1含量檢測 取組織勻漿上清液100μL，按ELISA試劑盒(RD公司分裝)說明書操作，檢測肺、腸組織ET-1水平。采用ELx800吸收光酶標儀在450nm處讀數。

1.3 統計學方法

采用SPSS 17.0軟件進行統計分析，數據以均數±標準差(±s)表示，2組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，相關性檢驗采用Spearman檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義，其中P＜0.01為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般表現

正常組大鼠毛色光澤，精神狀態、活動度良好，無異常表現。模型組大鼠隨著造模時間延長逐漸出現毛色萎黃、不同程度地脫毛、精神不振、活動減少、進食減量、鼻腔分泌物增多、咳嗽、噴嚏等頻繁癥狀。

2.2 肺、結腸組織病理形態觀察

正常組第20、50、70天肺和結腸組織均無顯著病理改變(見圖1～圖3)。模型組大鼠第20、50、70天肺和結腸組織出現病理改變的比率逐漸增加，分別為40%、70%和80%。可見支氣管上皮細胞變性、壞死，炎細胞浸潤，杯狀細胞增生，I型上皮細胞線粒體腫脹、內質網擴張，Ⅱ型肺泡上皮細胞增生、毛細血管基底膜增厚，肺泡壁纖維組織增生(見圖4);結腸黏膜及黏膜下炎細胞浸潤，部分微絨毛消失，線粒體腫脹，黏膜下固有層膠原纖維增生、見成纖維母細胞(見圖5、圖6)。

2.3 胃腸功能檢測結果

圖1 正常組70d肺組織(HE×100)

圖2 正常組70d結腸組織(HE×100)

圖3 正常組70d結腸組織(EM×700)

圖4 模型組70d肺組織(HE×100)

圖5 模型組70d結腸組織(HE×100)

圖6 模型組70d結腸組織(EM×700)

表1顯示，與正常組比較，第20天模型組大鼠胃內殘留率顯著升高，小腸推進率顯著降低(P＜0.01)，糞便含水率降低不顯著(P＞0.05);第50、70天模型組大鼠糞便含水率、小腸推進率均顯著降低(P＜0.01)，胃內殘留率顯著升高(P＜0.01)。模型組間比較，與第20天比較，第50、70天組大鼠糞便含水率、小腸推進率均顯著降低(P＜0.01)，胃內殘留率顯著升高(P＜0.05);與第50天比較，第70天組大鼠胃內殘留率顯著升高(P＜0.01)，小腸推進率顯著降低(P＜0.01)，糞便含水率顯著降低(P＜0.05)。

表1 各組大鼠第20、50、70天胃腸功能測定結果比較(±s)

表1 各組大鼠第20、50、70天胃腸功能測定結果比較(±s)

注:與同時間點正常組比較:＊＊P＜0.01;與模型組第20天比較:△P＜0.05，△△P＜0.01;與模型組第50天比較:▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

時間點 組 別 例數 糞便含水率 胃內殘留率 小腸推進率第20天 正常組＊＊△△▲▲8 0.63±0.09 0.32±0.03 0.85±0.04模型組 10 0.62±0.03 0.43±0.03＊＊ 0.73±0.05＊＊第50天 正常組 8 0.66±0.04 0.36±0.01 0.86±0.04模型組 10 0.49±0.06＊＊△△ 0.46±0.04＊＊△ 0.65±0.04＊＊△△第70天 正常組 8 0.63±0.02 0.37±0.02 0.85±0.04模型組 10 0.44±0.04＊＊△△▲ 0.52±0.03＊＊△△▲▲ 0.57±0.03

2.4 肺、結腸組織ET-1含量檢測結果

表2顯示，與正常組比較，第20天模型組鼠肺組織ET-1含量顯著升高(P＜0.01)，結腸組織ET-1含量升高不顯著(P＞0.05);第50、70天模型組大鼠肺、結腸組織ET-1含量均顯著升高(P＜0.01)。模型組間比較，與第20天比較，第50、70天組大鼠肺、結腸組織ET-1含量均顯著升高(P＜0.01);與第50天比較，第70天組大鼠肺、結腸組織ET-1含量均顯著升高(P＜0.01)。

2.5 慢支炎模型大鼠肺、結腸組織ET-1水平與胃腸功能各指標相關性

表2 各組大鼠第20、50、70天肺和結腸組織ET-1含量結果比較(±s，ng/L)

表2 各組大鼠第20、50、70天肺和結腸組織ET-1含量結果比較(±s，ng/L)

注:與同時間點正常組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與模型組第20天比較:△△P＜0.01;與模型組第50天比較:▲▲P＜0.01

時間點 組 別 例數 肺組織ET-1含量 結腸組織ET-1含量第20天 正常組8 87.39±6.33 54.89±8.81模型組 10 110.53±4.57* 57.10±6.89第50天 正常組 8 84.32±8.61 52.14±5.89模型組 10 133.32±6.17＊＊△△ 77.79±5.13＊＊△△第70天 正常組 8 81.71±6.72 55.21±9.21模型組 10 154.67±5.26＊＊△△▲▲ 96.64±4.24＊＊△△▲▲

模型組大鼠肺組織ET-1含量與胃內殘留率呈正相關(r=0.422，P=0.028)，與小腸推進率呈負相關(r=－0.487，P=0.026);模型組大鼠結腸組織ET-1含量與胃內殘留率呈正相關(r=0.459，P=0.017)，與小腸推進率呈負相關(r=－0.487，P=0.026)，與糞便含水率呈負相關(r=－0.282，P=0.043);肺組織ET-1含量與結腸組織ET-1含量呈正相關(r=0.873，P=0.009)。

3 討論

慢性支氣管炎(簡稱“慢支炎”)是氣管、支氣管黏膜及其周圍組織的慢性非特異性炎癥，臨床以咳嗽、咳痰為主要癥狀。慢性支氣管炎屬中醫學“咳嗽”范疇，主要病因病機為外感六淫、臟腑失調、邪犯于肺、肺氣上逆。肺與大腸相表里，肺氣以降為和，大腸以通為用。肺失宣降、腑氣不通則大腸傳導失施。《吳鞠通醫案·卷二》提到:“痰飲十數日，大便燥結，乃肺氣不降，肺與大腸相表里，肺氣痹則大腸亦痹。［6］”肺病治腸的理法方藥古已有之，如《傷寒論》242條:“喘冒不得臥者，有燥屎也，宜大承氣湯。”

內皮素是由內皮細胞合成的具有強烈縮血管作用活性的內源性肽類物質，最早由日本學者Yanagisawa等［7］從豬主動脈內皮細胞中分離純化出來，是目前發現最強的縮血管物質。內皮素有3種異構體，而活性最強的內皮素1(ET-1)可以使支氣管收縮，增強平滑肌細胞的超常增生和增殖，且上調炎癥反應。ET-1還能促進成纖維細胞膠原蛋白基因Ⅰ和膠原蛋白基因Ⅲ的表達，促進膠原蛋白沉積，最終導致肺纖維化［8］。ET不僅可由血管內皮細胞合成，也可由胃腸道黏膜上皮細胞合成，ET-1可致大鼠小腸黏膜下血管白細胞黏附［9］。ET-1介導的炎癥反應可以使小腸黏膜下微小血管收縮，毛細血管通透性增加，組織水腫、血流量減少，最終引起腸道局部缺血缺氧，組織損傷［10］。

慢性支氣管炎的發病與吸煙、大氣污染、感染、氣候寒冷以及機體內在因素均有關，其中吸煙是公認的最重要引起發病外因。煙草中含焦油、尼古丁和氫氰酸等化學物質，可損傷氣道上皮細胞，使支氣管黏液腺肥大、支氣管黏膜充血水腫、黏液聚集，還可使氧自由基產生增多，誘導中性粒細胞釋放蛋白酶，誘發肺氣腫形成［11］。煙熏法能較好模擬人類慢性支氣管炎的發病過程，且造模容易成功。課題組前期研究表明，無香煙品牌特異性干擾因素［4、5］，故本次實驗采用改良單純煙熏法建立大鼠慢支炎模型。研究結果顯示，慢支炎大鼠肺組織ET-1含量顯著高于正常組，慢支炎大鼠出現支氣管上皮細胞變性、壞死、炎細胞浸潤可能與ET-1促進炎癥反應有關。肺泡上皮細胞增生、毛細血管基底膜增厚、肺泡壁纖維組織增生可能與ET-1促進成纖維細胞膠原蛋白基因表達有關。模型組大鼠第20、50、70天肺組織ET-1含量逐漸升高，說明隨著煙熏干預時間延長，模型組大鼠肺組織損傷越嚴重。第50、70天慢支炎大鼠結腸組織ET-1含量顯著高于正常組，結腸黏膜及黏膜下炎細胞浸潤、部分微絨毛消失、線粒體腫脹、黏膜下固有層膠原纖維增生、見成纖維母細胞等，其損害可能與ET-1介導的腸道炎癥反應有關。慢支炎大鼠第20天結腸組織ET-1含量較正常組升高不顯著，普通光鏡和電鏡觀察結腸黏膜炎細胞浸潤不明顯，未引起結腸損傷。模型大鼠胃腸功能與肺腸組織ET-1含量有相關性，主要表現在胃內殘留率升高和小腸推進率降低，可能與大鼠胃腸損害導致胃排空及腸蠕動功能減弱有關。隨著干預時間延長，結腸組織ET-1含量逐漸升高，與肺組織ET-1含量呈顯著正相關，且結腸組織病理損害漸趨嚴重，提示“肺病及腸”的病理傳變與肺部病變的時間和程度相關，ET-1可能是介導慢支炎發生結腸病理損害的基礎物質之一。

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