DsRNA對小鼠肝細胞干擾素－α的表達影響

張 虎，杜欣娜，張淑紅，朱金玲，李春明，趙 璐，胡新俊

（1.佳木斯大學基礎醫學院，黑龍江 佳木斯154007；2.佳木斯大學附屬第二醫院，黑龍江 佳木斯154002；3.佳木斯中心醫院，黑龍江 佳木斯154002）

干擾素（Interferon，IFN）主要是糖蛋白，功能多樣，具有免疫活性。干擾素在抗病毒、增強免疫力和治療腫瘤方面作用巨大。一直以來干擾素一直是生命科學領域的研究重點和熱點。但是在臨床上，干擾素的不足之處在于半衰期短，且容易產生副作用。尋找合適的干擾素誘導劑成為了當今研究的焦點[1]。本課題研究了新鮮香菇dsRNA對于小鼠肝臟細胞的干擾素－α的表達影響，初步探討其中的機制，為尋找合適的干擾素誘導劑提供前期基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

佳木斯大學動物中心提供小鼠30只，體重（20±4）g，隨機分為對照組和實驗組。新鮮香菇購買于佳木斯市大潤發超市。

1.2 實驗方法

1.2.1 DsRNA的提取和鑒定

[2，3]，取新鮮香菇10g，液氮研磨，加入2倍體積的STE及酚／氯仿／異戊醇混合液抽提；2000rpm離心；取上清液，加入無水乙醇至終濃度的17%，注入預處理過的纖維素（CF－Ⅱ）柱中，最后用80mL含17%乙醇的1倍體積的STE液洗脫，再用不含乙醇的1倍體積的STE液洗脫；洗脫液用異丙醇、乙醇沉淀，真空抽干，得到dsRNA。

1.2.2 RT－PCR檢測干擾素－αmRNA的表達變化

1.2.2.1 動物處理

對照組小鼠不做任何處理，實驗組小鼠分為dsRNA注射0.5、5和50mg·kg－1三個組，12h后猝死所有小鼠，取肝臟，液氮保存，備用。

1.2.2.2 小鼠肝臟總RNA提取

TRIZOL法提取總RNA，操作步驟完全按照Invitrogen公司的說明書進行。

1.2.2.3 RT－PCR檢測干擾素－αmRNA的表達

① 反轉錄：依據試劑盒說明書20μL反應體系：

總RNA：2μg；10×反轉錄緩沖液：2μL；100mM dNTP：0.8μL；10×反轉錄隨機引物：2μL；50u／μL反轉錄酶：1μL；40u／μL RNA酶抑制劑：0.5μL；DEPC處理過的去離子水：補至20μL。

反轉錄條件：25℃10min，37℃120min，85℃5sec，反轉錄后的cDNA－20℃保存待用。

②PCR擴增：IFN－α引物序列：上游5＇CTGTGCTTTCCTGATGGT 3＇，下游5＇GAGTCTAGGAGGGTTGTATT 3＇，產物大小：309bp；

GAPDH引物序列：

上游5’GGGTGATGCTGGTGCTGAGTATGT3’，

下游5’AAGAATGGGAGTTGCTGTTGAAGTC 3’，產物大小：700bp。

PCR反應體系（20μL）：cDNA：1μL；2×Mix液：10μL；F P：0.5μL；R P：0.5μL；無菌雙蒸水：補至20μL

PCR反應條件：

95℃5min，95℃30sec，56℃30sec，72℃50sec，28個循環，72℃5min.

1.3 統計學處理

實驗所得數據采用SPSS18.0軟件進行t檢驗，計量資料以±s表示，P＜0.05表示差異具顯著。

表1 不同組間干擾素－αmRNA表達變化（n＝6，±s）

表1 不同組間干擾素－αmRNA表達變化（n＝6，±s）

注：＊P＜0.01vs對照組；＃P＜0.01vs 0.5mg·kg－1；＆P＜0.01vs 5mg·kg－1

指 標 對照組 0.5mg·kg－1 5mg·kg－1 50mg·kg－1干擾素－αmRNA 0.34±0.05 0.56±0.08＊ 0.73±0.11＊＃ 0.61±0.09＊＆

2 結果

見表1。

3 討論

1957年人們首次發現干擾素，生物學活性廣泛，具有廣譜的抗病毒、免疫調節和抗腫瘤作用，組成了機體防御的重要部分。IFN－α不能直接清除宿主病毒，而是通過抑制病毒復制來完成抗病毒作用，所以臨床上一旦停止使用干擾素，往往病情反復，甚至惡化。另外，干擾素容易產生副作用，長期使用對患者造成一定傷害。干擾素誘導劑巧妙的解決了這些問題，誘導劑促使機體本身產生干擾素，副作用不明顯[4，5]。

長雙鏈RNA（1ong double str anded RNA，dsRNA）具有較好的干擾素誘導活性。目前研究較多的是聚肌胞（Poly I：C），它是一種人工合成的dsRNA，其具有dsRNA的結構特性，在抗病毒和抗腫瘤的研究中應用較多。細胞膜的表面和胞漿內含有多種dsRNA的識別受體，dsRNA可以通過不同的細胞信號途徑來激活機體的非特異性免疫應答。這其中，比較最重要的是TLR3途徑和RNA解旋酶RIG－I／MDA5途徑[6，7]。本實驗提取新鮮香菇天然dsRNA，以不同濃度作用于小鼠，RT－PCR檢測了肝臟細胞內IFN－α的表達情況，結果顯示實驗組干擾素－αmRNA較對照組表達均顯著升高 （P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01），且濃度為5mg·kg－1dsRNA組干擾素－αmRNA的升高最顯著（P＜0.01，P＜0.01）。本實驗說明香菇天然dsRNA可以誘使小鼠肝細胞干擾素－αmRNA表達增加。dsRNA可以誘導干擾素生成這一發現為中藥抗病毒機制研究提供了一條新思路。中藥抗病毒作用機制往往不為西方醫藥界所認可，原因是中藥有效單體成分不明確。目前中藥抗病毒研究較多的成分是多糖。本研究提示dsRNA可能是中藥抗病毒的 又 一 有 效 成 分。2006 年，RNAi（RNA interference，RNAi）技術獲得了諾貝爾獎，小片段dsRNA可以與特定基因互補，特異性地降低或者關閉這基因表達。然而，同為dsRNA，卻可以一方面關閉基因的表達（RNAi），另一方面還可以誘導基因的表達（干擾素的生成），這似乎產生了一對“矛盾”，其中的機制未見有人闡述[1]。此外，天然dsRNA的來源、濃度、大小等對于哺乳動物不同組織、細胞的誘導作用的影響有待于進一步研究。天然長dsRNA如何進入細胞、細胞核以及如何誘導基因表達不是很明確，仍需要深入研究。

參考文獻：

[1]張虎，梁啟超，杜新娜，等.天然dsRNA誘導干擾素生成研究進展[J].黑龍江醫藥科學，2011，34（3）：54

[2]張曉婷，吳祖建，林奇英，等.雙鏈RNA技術與植物病毒研究[J].云南農業大學學報，2005，20（4）：455－458

[3]李東棟，牛建新，潘立忠.葡萄卷葉病病毒雙鏈RNA（dsRNA）提純分析研究[J].石河子大學學報（自然科學版），2000，4（3）：205－210

[4]李毅，金一，孫倫泉，等.雙鏈RNA的免疫調節作用及聚肌胞抗病毒應用進展[J].中國生化藥物雜志，2011，32（4）：335－338

[5]陳士俊.干擾素α的抗病毒作用機理[J].山東醫藥，1999，39（24）：38

[6]Vercammen E，Staal J，Beyaert R.Sensing of viral infection and activation of innate immunity by toll－like receptor 3[J].Clin Micro biol Rev，2008，21（1）：13－25

[7]Sasai M，Shingai M，Funami K，et al.NAK－associated protein 1participates in both the TLR3and the cytoplasmic pathways in type I IFN induction[J].J Immunol，2006，177（12）：8676－8683