血清EPCA－2聯合尿液PCA－3檢測在前列腺癌診斷中的臨床意義

胡存利，王 超，牛文斌，郝 鵬，郭玉剛，曹會峰，遲寶進

（1.佳木斯大學附屬第一醫院泌尿外科，黑龍江 佳木斯154003；2.夷陵醫院，湖北 宜昌443100）

隨著我國人均壽命的不斷增長與生活水平的逐步提高，近年來前列腺癌的發病率出現快速上升，故早期診斷和治療以提高前列腺癌的治愈率值得高度重視。直腸指診（digital rectal examination，DRE）、經直腸超聲檢查（transrectal ultrasonography，TRUS）和PSA測定等是目前前列腺癌診斷的重要手段，確診主要依靠前列腺穿刺活檢或病理。隨著研究的日益深入，利用PSA篩查前列腺癌的價值遭到廣泛質疑，而前列腺穿刺活檢又會造成一定的創傷，且可能會并發感染、出血、血管迷走神經反射及腫瘤種植等。故臨床上急需診斷前列腺癌更好、更準確的手段，以減輕患者的經濟和心理負擔。EPCA－2是一種與前列腺癌相關的核基質蛋白，有研究表明它能較病理切片提早5年或更多時間準確的診斷出前列腺癌[1]。PCA3是近幾年來所發現的一種最佳的前列腺癌特異基因，其表達僅在前列腺上皮細胞，且具有腫瘤特異性。為了探討血清EPCA－2聯合尿液PCA－3檢測在前列腺癌診斷中的臨床意義，本研究采用ELISA檢測前列腺癌患者血清EPCA－2的水平，同時采用RT－PCR檢測前列腺癌患者尿液PCA3基因表達情況。并探討二者的變化在前列腺癌診斷中是否具有協同效應，從而為前列腺癌的早期診斷提供更好的依據。

1 材料和方法

1.1 標本

2010－03～2012－12收治的BPH患者38例，年齡59～84歲，平均（71.0±6.6）歲，同期收治的前列腺癌患者26例，年齡56～83歲，平均（72.8±7.5）歲。兩組患者在年齡、性別和病史等方面沒有明顯差異，具有可比性。所有患者均經穿刺活檢或手術后病理確診。健康體檢者標本來自我院體檢中心。

1.2 實驗方法

所有病例均為入院第2天清晨空腹采血，采血前一周內未行導尿、DRE、前列腺按摩、TRUS及膀胱鏡檢查等，且一個月內未行前列腺穿刺，并排除入院前合并有急、慢性前列腺炎與急性尿潴留的患者，以最大限度減低可能干擾血清EPCA－2濃度的因素。血液采集以后，3000轉離心10min將血清和紅細胞快速仔細地分離，然后將血清用移液器移至EP管內待檢。標本如果無法立即檢測可以保存于－20℃冰箱中。采用EPCA－2酶聯免疫試劑盒（美國R＆B公司生產）分別檢測三組患者血清EPCA－2水平。所用酶標儀為芬蘭Labsystems Multiskan MS 352型。實驗操作嚴格按照說明書進行。以EPCA－2＞30ng／mL為前列腺癌的判定標準。尿液PCA－3的提取分為兩個步驟：（1）總RNA的提取：取前列腺按摩后的第一次尿液30mL，立即放入冰中冷卻。于3000rpm／10min離心收集尿沉渣，加等量冷D－hanks液洗滌兩次，放置在－70℃保存備用，按經典總RNA抽屜試劑盒說明書上提取總RNA后真空干燥，用15mL DEPC溶解，取2μL RNA溶液加入98μL水中，混勻后在微量分光光度計上測A260／A280比值及RNA含量。（2）RT－PCR檢測：先合成cDNA，取11μL RNA模板樣品，加oligo180.5μg／μL，具體操作按逆轉錄試劑盒說明書進行，總反應體積約20μL，最后取2μL來PCR擴增，在外顯子1和4之間設計一對PCA3引物，上游引物TGGGAAGGACCTGATGATACA＇，下游引物，CCCAGGGATCTCTGTGCTT。最后將擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳后經凝膠成像系統觀察有無406bp目的產物[2，3]。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 EPCA－2在正常對照組、前列腺癌組和BPH組測定結果

前列腺癌組患者血清EPCA－2水平為（56.32±16.96）ng／mL，明顯高于BPH組和正常對照組，差異有統計學意義（P＜0.01）。見表1。

表1 EPCA－2在正常對照組、PCa組和BPH組的水平（±s）

表1 EPCA－2在正常對照組、PCa組和BPH組的水平（±s）

組別 n EPCA－2（ng／mL）26 56.32±16.9610 9.02±1.46前列腺增生組 38 12.78±9.47前列腺癌組正常組

2.2 PCA－3在正常對照組、前列腺癌組和BPH組的表達情況

所有標本中，僅前列腺癌患者中見到一特異406bpPCA3電泳帶，其中健康體檢者和前列腺增生患者無PCA3表達，前列腺癌患者中都表達PCA3mRNA。

表2 PCA－3在正常對照組、PCa組和BPH組的表達情況

3 討論

核基質（nuclear matrix）是充盈于細胞核內的一種三維蛋白網架結構，而構成核基質主要成分的核基質蛋白（nuclear matrix proteins，NMPs）對DNA復制、轉錄和基因表達等方面都具有重要的調控功能，且具有組織細胞特異性及腫瘤相關性。研究表明，核基質及核基質蛋白的變化與各種組織（包括前列腺）的癌變有關[4]。因此，NMPs已被初步用于區分正常前列腺和前列腺癌。EPCA－2是近幾年發現的一種在前列腺癌中表達而在正常前列腺不表達的NMPs。研究人員[5]通過免疫抗體測定患者血液中的EPCA－2水平，結果發現97%的未罹患前列腺癌的患者EPCA－2結果為陰性，無癥狀的男性和患有其它惡性腫瘤及良性疾病的患者EPCA－2含量小于臨界值，90%的局限性前列腺癌患者和98%浸潤性前列腺癌患者EPCA－2含量等于或大于臨界值。總體上94%的前列腺癌可以通過EPCA－2篩查出來。以上結果提示EPCA－2可以作為前列腺癌篩查的腫瘤標記物。

本研究結果顯示，前列腺癌患者血清EPCA－2的水平為（56.32±16.96）ng／mL，明顯高于 BPH 組的（12.78±9.47）ng／mL，差異具有統計學意義 （P＜0.01）。這提示EPCA－2與前列腺癌變存在聯系，EPCA－2的測定有利于前列腺癌的診斷與鑒別診斷。若以EPCA－2＞30ng／mL為前列腺癌的判定標準，其預測前列腺癌的特異性達91.2%，敏感性達95.4%。但是，在臨床上發現，EPCA－2在前列腺癌中診斷的特異性并非100%，可能會引起漏診，若同時檢測患者尿液PCA－3可以起到輔助診斷的作用。

PCA3基因是1999年bussemakers等[6]發現的一種前列腺癌特異基因，它是一種非編碼RNA。通過Northernblot法分析該基因特異性表達與前列腺癌細胞，正常前列腺細胞，前列腺增生的細胞中不表達或者僅少量表達，在其他腫瘤組織中不表達。此外，2002年De KOK等[7]研究也得出PCA3在正常組織和良性前列腺增生組織中有非常少表達的結果。但是前列腺癌PSA基因的表達與前列腺增生組織相比無顯著差異。與PSA基因相比，PCA3基因是一個前列腺癌特異性很強的基因。本實驗是建立在RT－PCR基礎上，檢測前列腺癌按摩后尿液PCA3基因的表達進行分析。經前列腺按摩后，前列腺細胞通過前列腺管進入尿道。前段尿中含有前列腺細胞最多。由于不同的標本中含有前列腺細胞數量不一樣，每微克RNA所含前列腺細胞的比例也不同，需要用管家基因對其校正，本實驗選擇PSA作為管家基因，已經證實PSA基因在正常前列腺細胞表達較恒定，在前列腺癌細胞中輕微下降。本實驗對前列腺按摩后尿液PCA3基因定性分析結果顯示：前列腺癌患者尿液PCA3基因表達呈陽性，前列腺增生患者尿液PCA3基因表達為陰性，差異具有統計學意義（P＜0.01）。這說明尿液PCA3基因可以鑒別前列腺癌患者和非前列腺癌患者。

本實驗證實，EPCA－2存在于前列腺腫瘤細胞中，表明EPCA－2檢測可以為前列腺癌早期診斷提供依據，同時也證實，在前列腺癌發生過程中，PCA－3表達也明顯增高。因此可以推斷，EPCA－2與PCA－3聯合檢測可以為前列腺癌的早期診斷提供依據，從而減少很多不必要的過度診斷和過度治療，降低患者的心理負擔和社會、經濟成本。

[1]Dhir R，Vietmeier B，Arlotti J，et al.Early identification of individuals with prostate cancer in negative biopsies[J].J Urol，2004，171（4）：1419－1423

[2]羅振國，蒲永昌，王天喜.尿液PCA3基因檢測在前列腺癌診斷中的意義[J].黑龍江醫藥科學，2010，33（3）：58－59

[3]羅振國，王超，陶然，等.血清PSA、fPSA／tPSA在前列腺癌診斷中的臨床意義[J].黑龍江醫藥科學，2012，35（1）：32－33

[4]Brunagel G，Schoen RE，Bauer AJ，et al.Nuclear matrix protein alterations associated with colon cancer metastasis to the liver[J].Clin Cancer Res，2002，8（10）：3039－3045

[5]Getzenberg，Leman ES，Cannon GW，et al.EPCA－2：A Highly Specific Serum Marker for Prostate Cancer[J].J Urol，2006，175（4）∶275－275

[6]Bussemakers MJ，Van BA，Verhaegh GW，et al.DD3：a new prostate－specific gene，highly overexpressed in prostate cancer[J].Cancer Res，1999，59：5975－5979

[7]de Kok JB，Verhaegh GW，Roelofs RW，et al.DD3（PCA3），a very sensitive and specific marker to detect prostate tumors[J].Cancer Res，2002，62：2695－2698