急性動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死患者外周血CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）水平的變化及臨床意義

劉曉陽，康春陽，韓瑩瑩，陳加俊，王立波，趙之恭

（吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，吉林 長春130033）

患者發(fā)生急性心肌梗死后其外周血CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）數(shù)量明顯減少，本研究測定了急性動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死患者外周血CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）的水平并探討其在缺血性腦損傷中的臨床意義。

1 對(duì)象和方法

1．1 對(duì)象

收集2012年2－12月在吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院的急性期腦梗死患者和同期住院健康體檢者78例。其中對(duì)照組30例，為同期住院健康體檢者，其中男性18例、女性12例，平均年齡56．60±5．96歲，均無吸煙及酗酒史、卒中家族史、冠心病、高血壓、糖尿病、血脂異常等腦血管危險(xiǎn)因素。梗死組48例，為發(fā)病7天內(nèi)的急性期腦梗死住院患者，其中男性33例、女性15例，平均年齡56．36±6．86歲。本研究所納入的急性期腦梗死病例均符合全國第四屆腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)病史、頭顱CT和（或）MRI頸部血管彩超及TCD檢查證實(shí)，入選病例均為發(fā)病7天內(nèi)的住院病人，且近2個(gè)月內(nèi)未服用應(yīng)用炎癥抑制藥物如非甾體類抗炎藥、類固醇、免疫抑制劑及鴉片類藥物等可影響外周血CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）水平的藥物。排除標(biāo)準(zhǔn)：①血液系統(tǒng)及自身免疫性疾病、全身活動(dòng)性感染者；②近3個(gè)月患急性心肌梗死、血管閉塞性疾病，心源性腦栓塞和腦出血史者；③嚴(yán)重心、肝、腎功能不全及代謝性疾病者；④近3個(gè)月內(nèi)有外科手術(shù)、炎癥、腫瘤及輸血等影響CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）水平的患者；⑤嚴(yán)重的其他系統(tǒng)疾病者。

1．2 方法

1．2．1 評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 依據(jù)美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表（NIH Stroke Scale，NIHSS）進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分：0－15分為輕度神經(jīng)功能缺損組、16－30分為中度神經(jīng)功能缺損組、31－45分為重度神經(jīng)功能缺損組；依據(jù)Pullicino公式（長×寬×CT或MRI掃描陽性層數(shù)／2）計(jì)算梗死病灶體積，并分為小、中、大灶三組，＜5cm3為小灶組，5－10cm3為中灶組，＞10cm3為大灶組；經(jīng)頸動(dòng)脈血管超聲證實(shí)有頸動(dòng)脈粥樣硬化（CAS），根據(jù)彩色多普勒超聲儀檢測結(jié)果，動(dòng)脈內(nèi)膜光滑、IMT＜1．0mm者為正常頸動(dòng)脈，1．0mm≤IMT＜1．5mm為頸動(dòng)脈內(nèi)膜增厚，IMT≥1．5mm且增厚的內(nèi)膜向管腔內(nèi)凸出為有粥樣斑塊形成，動(dòng)脈管腔狹窄率≥50%者認(rèn)為存在動(dòng)脈狹窄。根據(jù)病變程度分為三組：頸動(dòng)脈內(nèi)膜增厚組（A亞組）19例，頸動(dòng)脈斑塊組（B亞組）15例及頸動(dòng)脈狹窄組（C亞組）14例。

1．2．2 標(biāo)本采集及檢測方法 入院后次日清晨空腹采集肘靜脈血2ml，標(biāo)本采集后置于抗凝真空管中，并存放于室溫下。新鮮樣本3小時(shí)之內(nèi)進(jìn)行樣本處理。取2支FCM試管，分別標(biāo)記為染色管和對(duì)照管，均加入100μl抗凝血，染色管中加入CD4－PE和CD25－FITC各10μl，對(duì)照管加入CD4－PE和IgG1－FITC各10μl，充分混勻室溫避光孵育15分鐘；加入紅細(xì)胞裂解液500μl于兩支試管中，充分混勻室溫避光4℃避光孵育10min，加入PBS液500μl于兩支試管中，混勻，以1 500r／min離心5 min，棄去上清液，加入PBS液500μl重懸后，上機(jī)檢測；用CXP－cytometer軟件獲取和分析10000個(gè)細(xì)胞，在側(cè)向角散射光參數(shù)點(diǎn)圖上對(duì)淋巴細(xì)胞群設(shè)窗，收集細(xì)胞數(shù)共10000個(gè)，以此群體統(tǒng)計(jì)CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）的百分比。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所用數(shù)據(jù)均行正態(tài)分布檢驗(yàn)，正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示；兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較應(yīng)用方差分析，兩兩比較采用LSD法；P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0．01為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 梗死組不同神經(jīng)功能缺損程度患者外周血CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）水平比較 梗死組不同神經(jīng)功能缺損程度患者外周血CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）百分比均較對(duì)照組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）；其中，重度組外周血CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）百分比低于中度組，中度組外周血CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞（Treg）百分比低于輕度組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）（見表1）。

表1 梗死組不同神經(jīng)功能缺損程度患者外周血Treg水平比較（%，xˉ±s）

2．2 梗死組不同梗死病灶體積患者外周血CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）水平比較 梗死組不同梗死病灶體積患者外周血CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）百分比均較對(duì)照組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）；其中，大灶組外周血 CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）百分比低于中灶組，中灶組外周血CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）百分比低于小灶組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）（見表2）。

表2 梗死組不同梗死病灶體積患者外周血Treg水平比較（%，xˉ±s）

2．3 梗死組不同頸動(dòng)脈粥樣硬化程度患者外周血CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）水平比較 研究結(jié)果顯示，頸動(dòng)脈內(nèi)膜增厚組（A亞組）、頸動(dòng)脈斑塊組（B亞組）、頸動(dòng)脈狹窄組（C亞組）三組患者外周血CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）百分比均較對(duì)照組降低，表明急性腦梗死患者外周血CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）水平隨CAS程度的加重而降低。其中，C亞組外周血CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）百分比低于B亞組，B亞組外周血CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）百分比低于A亞組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）（見表3）。

表3 梗死組不同CAS程度患者外周血Treg水平比較（%，xˉ±s）

2．4 外周血Treg水平與頸動(dòng)脈內(nèi)－中膜厚度（IMT）比較 本研究還發(fā)現(xiàn)外周血CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）百分比與頸動(dòng)脈IMT值有相關(guān)性，即外周血CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）百分比與頸動(dòng)脈內(nèi)－中膜厚度（IMT）呈顯著負(fù)相關(guān)（r＝－0．543，P＜0．01）（見表4）。

表4 外周血Treg水平與頸動(dòng)脈內(nèi)中膜厚度（IMT）比較（%，ˉx±s）

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化性腦卒中呈年輕化趨勢，發(fā)病率及死亡率逐年增高，嚴(yán)重威脅著人類的健康［1］，而動(dòng)脈粥樣硬化本身及繼發(fā)于動(dòng)脈粥樣硬化病變基礎(chǔ)上形成的腦梗死都存在炎性免疫反應(yīng)［2－4］，甚至認(rèn)為，過度表達(dá)的局部炎性反應(yīng)對(duì)缺血區(qū)腦組織的損傷要比缺血本身更嚴(yán)重，抑制其后過度表達(dá)的炎性反應(yīng)，調(diào)節(jié)致病性T細(xì)胞（Tp）和免疫調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tr）等的動(dòng)態(tài)平衡，已成為當(dāng)今治療動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死的重要靶點(diǎn)［5］。國內(nèi)外已有大量文獻(xiàn)報(bào)道，CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）作為一類新型的免疫調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，在急性心肌梗死后其外周血數(shù)量明顯減少［6，7］。

本研究顯示：梗死組不同神經(jīng)功能缺損程度患者外周血CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）百分比均較對(duì)照組顯著降低。不同梗死病灶體積患者外周血CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）百分比均較對(duì)照組明顯降低。神經(jīng)功能缺損評(píng)分的高低及梗死體積的大小往往代表著腦梗死的嚴(yán)重性，兩者均與急性動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死患者外周血CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）水平呈負(fù)相關(guān)。表明外周血CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）數(shù)量關(guān)系到早期缺血性腦卒中的嚴(yán)重程度，提示其可作為反映缺血性腦損傷嚴(yán)重程度的敏感指標(biāo)。這種相關(guān)性變化的機(jī)制復(fù)雜，可能為多重原因所致CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）生成減少，消耗增多及自身凋亡等免疫調(diào)節(jié)失衡所致。有待于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)觀察及臨床研究。

本研究還發(fā)現(xiàn)外周血CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）百分比與頸動(dòng)脈內(nèi)－中膜厚度（IMT）呈顯著負(fù)相關(guān)。機(jī)制可能為：①生成減少，動(dòng)脈粥樣硬化形成及加重的過程伴隨著氧化型低密度脂蛋白（ox－LDL）的生成［8－10］，血管內(nèi)皮細(xì)胞的破壞［11］，單核細(xì)胞的侵潤，CD4＋T細(xì)胞更傾向于分化為Th1細(xì)胞，活化的Th1細(xì)胞會(huì)分泌致炎因子，此時(shí)機(jī)體異常激活狀態(tài)的免疫反應(yīng)抑制外周血CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）的生成，使其數(shù)量逐漸減少。②消耗增多，CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）能抑制內(nèi)皮細(xì)胞分泌炎性因子的表達(dá)［11］，抑制受損內(nèi)皮細(xì)胞的抗原遞呈功能［11］，促進(jìn)外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）增殖、遷移、黏附，而血管內(nèi)皮細(xì)胞功能受損是動(dòng)脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)［12］，所以持續(xù)的內(nèi)皮損傷和功能障礙會(huì)導(dǎo)致外周血CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）過度消耗甚至衰竭；③自身凋亡，動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展的過程伴隨著氧化應(yīng)激的逐漸加重，氧化應(yīng)激可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，國內(nèi)外研究表明CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）對(duì)誘導(dǎo)凋亡特別敏感，使其凋亡增加，使外周血CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）更加減少。他汀類藥物具有抗氧化應(yīng)激作用，可能就是通過抑制外周血CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）的凋亡，從而發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣作用。Xue Keying等通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明丹參注射液可以通過促進(jìn)外周血CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）的產(chǎn)生，抑制效應(yīng)性CD4＋T細(xì)胞尤其是Th1細(xì)胞及其分泌致炎因子的活化而揮抗炎及免疫調(diào)節(jié)作用［13］。

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