整合素αvβ3與腦膠質瘤惡性程度的相關性研究

郭鵬德，馬慶杰，王振常，高 識，紀鐵鳳

（1．首都醫科大學附屬北京同仁醫院 北京100730；2．吉林大學中日聯誼醫院 核醫學科 吉林 長春130033）

腦膠質瘤是神經系統最常見的惡性腫瘤，起源于神經外胚層的腫瘤，占顱內腫瘤的50%［1］。腫瘤術后復發率高，受多種蛋白分子調控，包括整合素αvβ3，其在成熟血管內皮細胞和絕大多數正常組織不表達或低表達［2］，而在新生血管內皮細胞表面及多種惡性腫瘤細胞表面表達顯著增加。腫瘤新生血管內皮細胞為遺傳穩定性的非惡性內皮細胞，其表面的整合素αvβ3受體沒有突變的可能，而且其在這些細胞表面直接接觸循環血液，易于接近藥物，適用于作為腫瘤治療的靶，但整合素αvβ3在腦膠質瘤細胞的表達情況尚不明確。本研究采用免疫組織化學方法檢測整合素αvβ3在腦膠質瘤的表達情況，分析其與腦膠質瘤惡性程度之間的關系，為進一步整合素αvβ3的靶向治療提供參考。

1 資料與方法

1．1 病理資料 20例腦膠質標本來源于吉林大學中日聯誼醫院，其中男12例，女8例，年齡范圍26－68歲（平均40．87±12．9歲）（表1），所有患者術前均未進行放療或化療，術后均經病理診斷為腦膠質瘤。術后病理標本行常規HE染色，并按照《WHO中樞神經系統腫瘤組織學分類》（2007）標準［3，4］進行分類。每例切片均經兩位經驗豐富的病理科醫生對微血管密度和腫瘤細胞進行分析。依據術后病理檢查結果，將患者分為低度惡性組（low malignant group，LM）（Ⅰ－Ⅱ級）和高度惡性組（high malignant group，HM）（Ⅲ－Ⅳ級）。

1．2 主要試劑 抗αvβ3生物素單克隆抗體購自Chemicon Europe公司，10%中性甲醛、PBS緩沖液、乙醇、二甲苯、石蠟、蒸餾水、10%雙氧水、檸檬酸、檸檬酸鈉、氨水、鹽酸、過氧化氫、NaCl、DAB胰酶、蘇木素、中性樹膠、正常山羊血清工作液均購自北京化學試劑公司。

1．3 免疫組化方法

1．3．1 切片 修剪腫瘤組織，然后切成約0．5cm的薄片，立即投入10%中性甲醛－PBS緩沖液內，在4℃溫度下固定24h；應用TISSUE—TEKVIP TEC包埋機自動包埋；在LEICA SM 2000R切片機中連續切片，厚度3μm；在80℃ 條件下烤片1h，60℃過夜。

1．3．2 免疫組織化學技術 將烤好的切片常規脫蠟水化，10%雙氧水處理10min，封閉內源性過氧化物酶活性。用0．1MPBS洗滌3次，每次10min。滴加封閉用正常山羊血清工作液，室溫孵育30 min，傾去；滴加1∶100將抗αvβ3生物素單克隆抗體LM609，室溫孵育1h；0．1MPBS洗滌3次（每次10min）。滴加0．04%DAB 1ml與1μl 30%過氧化氫混合液顯色，用鏡下控制抗體顯色時間，以流水進行洗滌終止顯色反應。然后蒸餾水浸泡3 min，蘇木素復染1min，經鹽酸酒精分化，氨水反藍后，常規梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。顯微鏡下觀察染片情況，照相。

1．4 結果判斷 每例切片均經兩位經驗豐富的病理科醫生對微血管密度和腫瘤細胞進行分析。免疫組化采用雙盲讀片，高倍鏡下對每張切片隨機取4個視野，αvβ3受體染色以棕黃色顆粒、背景清晰為陽性表達。“–”為無細胞著色，“＋”為低度表達，“＋＋”為中度表達，“＋＋＋”為高度表達。

1．5 統計學處理 計量資料結果以ˉx±s表示，采用相關性分析。計數資料采用χ2檢驗，相關分析采用Peason及Spearman等級相關分析；顯著性水平＝0．05，統計軟件為SPSS 16．0。

2 結果

整合素αvβ3表達情況與患者年齡、性別、腫瘤部位等無關，主要表達于細胞膜、胞質、血管內皮及腫瘤周圍浸潤組織，呈棕黃色顆粒（圖1）。腫瘤周圍水腫、正常及壞死組織未見αvβ3表達。

10例低度惡性膠質瘤中，αvβ3中度表達4例，低度表達6例；10例高度惡性膠質瘤中，αvβ3高度表達9例，中度表達1例 （表1、表2）。高度惡性組αvβ3的表達高于低度惡性組，兩組間存在顯著性差異（χ2＝16．80，P＝0．000，P＜0．05）。

表1 HE染色及整合素αvβ3表達結果

根據腫瘤直徑（Td），Td≤2．5cm，2．5cm＜Td≤3．5cm，Td＞3．5cm）分為三組，其與整合素αvβ3表達情況無明顯相關性（r＝0．087，P＝0．715，P＞0．05）（表2）。

表2 整合素αvβ3表達與組織學分級、腫瘤直徑的關系結果

圖1 整合素αvβ3表達

3 討論

腦膠質瘤發生發展過程中伴隨著血管系統的建立、新血管的形成。低度惡性膠質瘤血管結構與正常組織接近，而高度惡性膠質瘤卻有明顯微血管（即平滑肌／血管周圍細胞和血管內皮細胞）增生，且密度明顯增加，遠遠高于低度惡性膠質瘤和正常腦組織。微血管增生的機制可能有兩種：一是血管生成，通過腫瘤周圍正常腦組織中的毛細血管出芽而生成。二是通過平滑肌細胞／血管周細胞增生和聚集進行血管重塑。在血管生成過程中，一系列蛋白調節參與，如 VEGF－1、VEGF－2和整合素αvβ3等［5］。

αvβ3是整合素家族的重要一員，介導腫瘤細胞的黏附和移行，在腫瘤生長、局部浸潤和遠處轉移方面有重要作用［6－8］。研究表明［5，9，10］，αvβ3 在新生血管和惡性腫瘤內膜表面表達明顯增加，在成熟血管內皮表達較低。αvβ3作為新生血管和惡性腫瘤細胞內膜的標記物，當腫瘤向低度分化進展、新生血管數量增加，其表達也會迅速增加。應用一定數量的抗αvβ3抗體，可有效阻止腫瘤細胞的遠處轉移、生長和浸潤。

研究證實，αvβ3與細胞外基質和基質金屬蛋白酶相互作用，促進惡性腫瘤細胞的周圍浸潤和遠處轉移。本研究采用免疫組化檢測到αvβ3在不同組織學分型的腦膠質瘤中表達不一致，在腫瘤壞死區、周圍正常組織不表達，在細胞膜、胞漿、血管內皮和周圍浸潤組織表達（圖1）；且表達程度隨腦膠質瘤組織學分級的升高而呈上升趨勢，在高度惡性組的表達明顯高于低度惡性組，兩組（HM＆LM）間的表達存在顯著性差異（χ2＝16．80，P＝0．000，P＜0．05），與其他研究者結果相同［9，11］。

腦膠質瘤術后復發率高是由惡性增殖、新血管形成增加和侵襲性生長決定的。腦膠質瘤可以沿細胞外基質蛋白生長。整合素αvβ3在腫瘤周圍組織的表達提示其在腫瘤細胞浸潤過程中起重要作用，而且腫瘤浸潤同樣會使αvβ3表達增加［12］。在腫瘤周圍組織表達的可能原因是整合素αvβ3與相關配體結合，將細胞內各種蛋白，踝蛋白、鈕蛋白和肌動蛋白等定位于某一固定黏附點，從而引起細胞內一系列信號轉導過程，如活化酪氨酸激酶，參與調節細胞骨架和細胞內外信號轉導，影響細胞的運動和生物學功能。腫瘤浸潤過程中，新血管的生成不僅為腫瘤細胞提供營養，同時為腫瘤轉移提供通道。研究表明［13］，整合素αvβ3可以介導多種生物因子激活和信號轉導功能，誘導新生血管生成。因此腦膠質瘤侵襲性轉移的特性與新生血管的形成密不可分，有著共同的生物學機制［14］。同時研究證明［15，16］，整合素 αvβ3在膠質瘤細胞和血管內皮細胞增殖和浸潤過程中起重要作用。因此在本研究中，同樣可以看到αvβ3在新血管和周圍浸潤組織表達增加（圖1），表明在誘導腫瘤血管生成過程中，整合素αvβ3起重要作用。而且，相關研究證實［16］，腫瘤組織學分級惡性程度高、細胞分化低，則腫瘤細胞侵襲力強、細胞增殖明顯，αvβ3表達程度高；惡性程度低、細胞分化高，則腫瘤細胞浸潤力低、細胞增殖不明顯，αvβ3表達成度低，與本結果研究一致。

［1］湯釗猷．現代腫瘤學（第3版）［M］．上海：復旦大學出版社，2011：1648－1649．

［2］Hynes RO．Integrins：bidirectional，allosteric signaling machines［J］．Cell，2002，110（6）：673．

［3］Thurnher MM．2007World Health Organization classification of tumours of the central nervous system［J］．Cancer Imaging，2009，No（A）：S1．

［4］Louis DN，Ohgaki H，Wiestler OD，et al．The 2007WHO classification of tumours of the central nervous system［J］．Acta Neuropathol，2007，114（2）：97．

［5］Paul Kleihues，W．K．Cavanee．Pathology ＆genetics：Tumours of the nervous system （2nd edition）［M］．Oxford University Press，2000：8－11．

［6］Haubner R，Wester HJ，Burkhart F，et al．Glycosylated RGD－containing peptides：tracer for tumor targeting and angiogenesis imaging with improved biokinetics［J］．J Nucl Med，2001，42（2）：326．

［7］Mitra A，Nan A，Papadimitriou JC，et al．Polymer－peptide conjugates for angiogenesis targeted tumor radiotherapy［J］．Nucl Med Biol，2006，33（1）：43．

［8］Brooks PC，Clark RA，Cheresh DA．Requirement of vascular integrin alphavbeta3for angiogenesis［J］．Science，1994，264（5158）：569．

［9］靳曉娜，史繼云，劉 妍，等．99Tcm標記新型RGD環肽在神經膠質瘤動物模型的實驗研究［J］．中華核醫學雜志，2010，30（3）：195．

［10］Carmeliet P．Angiogenesis in health and disease［J］．Nat Med，2003，9（6）：653．

［11］劉昭飛，賈 兵，史繼云，等．99Tcm－RGD環肽二聚體的制備及其體內外評價［J］．中華核醫學雜志，2007，27（4）：205．

［12］Schittenhelm J，Schwab EI，Sperveslage J，et al．Longitudinal Expression Analysis of alphav Integrins in Human Gliomas Reveals Upregulation of Integrin alphavbeta3as a Negative Prognostic Factor［J］．J Neuropathol Exp Neurol，2013，72（3）：194．

［13］Kanamori M，Vanden BSR，Bergers G，et al．Integrin beta3over expression suppresses tumor growth in a human model of gliomagenesis：implications for the role of beta3overexpression in glioblastoma multiforme［J］．Cancer Res，2004，64（8）：2751．

［14］Nagarajan SR，Devadas B，Malecha JW，et al．R－isomers of Arg－Gly－Asp（RGD）mimics as potent alphavbeta3inhibitors［J］．Bioorg Med Chem，2007，15（11）：3783．

［15］Huveneers S，den Bout IV，Sonneveld P，et al．Integrin alphavbeta3controls activity and oncogenic potential of primed c－Src［J］．Cancer Res，2007，67（6）：2693．

［16］Hanahan D，Folkman J．Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis［J］．Cell，1996，86（3）：353．