過氧化物酶體增殖物激活受體β／δ激動(dòng)劑GW0742對(duì)硝酸甘油誘導(dǎo)偏頭痛大鼠的作用

肖明明，何 秋，任占秀，陳曉虹

（遼寧省人民醫(yī)院1．病理科；2．神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 沈陽110016）

偏頭痛（migraine）是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。最新流行病學(xué)調(diào)查表明，我國偏頭痛的患病率、發(fā)病率有逐年上升的趨勢(shì)［1］。過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferators－activated receptor，PPAR）是核受體超家族成員之一，包括PPARα、PPARβ／δ 和 PPARγ 三種表型。PPARα和PPARγ激動(dòng)劑的抗炎作用已通過大量研究證實(shí)，但是 PPARβ／δ的作用仍不十分清楚［2］。研究PPARβ／δ在炎癥等疾病中的表達(dá)可能具有十分重要的意義［3］。因此，建立客觀有效的偏頭痛實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，深入研究PPARβ／δ激動(dòng)劑對(duì)偏頭痛的發(fā)病機(jī)理及防治措施十分必要。

1 材料與方法

1．1 材料

硝酸甘油購于廣州白云山制藥有限公司；PPARβ／δ，IL－6，ICAM－1，MMP－9試劑盒購于Santa Cruz公司；GW0742由Sigma生產(chǎn)，批號(hào)：096K 4711。GW0742溶于二甲基亞砜溶劑（dimethylsulfoxide，DMSO）中。

1．2 實(shí)驗(yàn)分組及造模

48只SD雄性大鼠（體重180－220g）由沈陽藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供。動(dòng)物許可證號(hào)，No：SCXK（遼）2010－0001。按體重均衡原則，將大鼠隨機(jī)分成：正常對(duì)照組、模型組和GW0742組，每組16只。模型組按Tassorelli Cristina法采用腹腔皮下注射硝酸甘油復(fù)制大鼠偏頭痛模型。GW0742組在造模后3 0min腹腔給予 GW0742 0．3mg／kg。正常對(duì)照組不做處理。

1．3 偏頭痛模型制備

取大鼠稱重，大鼠按9．5mg／kg皮下注射硝酸甘油5－10min所有造模后大鼠出現(xiàn)雙耳發(fā)紅，肢頻繁撓頭、爬籠次數(shù)增多、煩躁不安等現(xiàn)象。據(jù)模型評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)（潛伏期后5min，計(jì)分達(dá)6分為造模成功）。對(duì)照組大鼠皮下注射等體積生理鹽水，大鼠僅在15 min內(nèi)略有撓頭現(xiàn)象，之后趨于正常，且未出現(xiàn)雙耳發(fā)紅、爬籠次數(shù)增多和其他煩躁不安現(xiàn)象［4］。

偏頭痛模型評(píng)價(jià)：根據(jù)本研究預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，潛伏期后5min內(nèi)出現(xiàn)癥狀最為集中和明顯。所以確定潛伏期后5min計(jì)分達(dá)6分為造模成功。前5 min搔頭：10次＝1分（依10次為基數(shù)，增加1次，增加0．1分），打轉(zhuǎn)：2次＝1分（增加1次，增加1分），爬籠：3次＝1分（增加1次，增加0．1分），煩躁：往返運(yùn)動(dòng)1次＝1分（增加1次，增加1分），咬尾：1次＝1分，耳紅：出現(xiàn)＝1分［5］。

取材：造模成功4h后，10%水合氯醛麻醉后暴露心臟，從心尖插入灌流針直至主動(dòng)脈，剪開右心耳，用0．9%生理鹽水沖洗至流出水無色后，每組取8只鼠的腦干三叉神經(jīng)頸復(fù)合體，迅速置入液氮中保存，備用于western blot檢測(cè)；另8只鼠在上述生理鹽水沖洗后用4%多聚甲醛灌流，直至腦組織發(fā)白、質(zhì)地較硬后灌流結(jié)束。斷頭取腦干三叉神經(jīng)頸復(fù)合體，放入4%多聚甲醛液中固定，24h后移入70%乙醇中保存，常規(guī)石蠟脫水、包埋，待做免疫組化。

1．4 免疫組織化學(xué)

石蠟組織切片行常規(guī)HE染色，顯微鏡下觀察確定組織結(jié)構(gòu)未被破壞，行脫蠟和水化后，用0．01 mmol／L枸櫞酸鹽修復(fù)，冷卻至室溫；新配的3%H2O2，室溫下處理10min，蒸餾水洗滌切片2min×3次；滴加封閉用正常山羊血清工作液體，37℃孵育20min；滴加適當(dāng)一抗［PPARβ／δ（1∶200）、IL－6（1∶200）、ICAM－1（1∶200）、MMP－9（1∶200）］，4℃過夜；PBS沖洗，3min×3次，滴加生物素抗體，37℃孵育20min；PBS沖洗，3min×3次，滴加適量的辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，37℃孵育20 min，PBS沖洗，3min×3次，DAB顯色：取1ml蒸餾水分別加入A、B、C試劑各一滴，混勻后加至切片上，顯色5－10min，水洗；蘇木素輕度復(fù)染，水洗，脫水、透明、封片，鏡檢觀察。

結(jié)果判斷：PPARβ／δ蛋白定位于細(xì)胞核，IL－6、ICAM－1、MMP－9蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)。根據(jù)陽性細(xì)胞百分率評(píng)分：無陽性細(xì)胞為（－），陽性細(xì)胞數(shù)≤10%（＋），11%≤陽性細(xì)胞數(shù)≤50%為（＋＋），陽性細(xì)胞數(shù)≥51%為（＋＋＋）。

1．5 Western－blot印 跡 法 檢 測(cè) PPARβ／δ、IL－6、ICAM－1及 MMP－9表達(dá)

1．5．1 蛋白提取 分別取凍存的組織，加0．5ml冰冷蛋白裂解緩沖液（0．1mM Tris－HCl pH7．6，1 mM EDTA pH8．0，1μg．ml－1Aprotinin，100μg·ml－1PMSF），冰浴中勻漿，4℃、10 000×g離心1h；棄上清，沉淀物中加入0．5ml細(xì)胞核或膜裂解緩沖液，超聲粉碎，4℃、20 800×g離心1h，吸出上清（分別含胞核蛋白或胞膜蛋白），采用Folin－酚試劑法進(jìn)行蛋白定量，－70℃保存待用。

1．5．2 Western－blot印跡 分別取含30μg含胞核蛋白或胞膜蛋白的上述溶液，加在10%SDS－聚丙烯酰胺凝膠中，在pH 為8．3的0．025M／L Tris－192μm／L 甘氨酸－0．1%SDS中電泳（120V、38 mA）2h。電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維薄膜上，轉(zhuǎn)印膜在牛血清白蛋白中封閉1小時(shí)后，分別在一抗［PPARβ／δ（1：200）、IL－6（1∶200）、ICAM－1（1∶200）、MMP－9（1∶200）］中4℃孵育過夜。次日，充分清洗轉(zhuǎn)印膜后，轉(zhuǎn)入堿性磷酸酶（1∶3000稀釋）標(biāo)記的二抗中室溫孵育2h，PBS沖洗3次，顯色30s。凝膠自動(dòng)成像儀掃描成像，圖像分析儀對(duì)顯示的蛋白電泳條帶進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

測(cè)定數(shù)值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，兩組間均數(shù)比較用t檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用SPSS13．0統(tǒng)計(jì)軟件處理，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）

2 結(jié)果

2．1 大鼠行為學(xué)變化

造模5－10min后大鼠出現(xiàn)耳發(fā)紅，肢頻繁撓頭、爬籠次數(shù)增多、煩躁不安等現(xiàn)象約30min達(dá)高峰。此現(xiàn)象可持續(xù)1h。繼之大鼠呈現(xiàn)蜷臥，活動(dòng)減少狀態(tài)。期間無大鼠死亡，根據(jù)偏頭痛模型評(píng)價(jià)，大鼠模型結(jié)果符合標(biāo)準(zhǔn)。

2．2 免疫組織化學(xué)

模型組大鼠三叉神經(jīng)頸復(fù)合體中PPARβ／δ表達(dá)強(qiáng)度明顯高于正常對(duì)照組。同時(shí)模型組大鼠三叉神經(jīng)頸復(fù)合體IL－6、ICAM－1、MMP－9表達(dá)強(qiáng)度明顯高于正常對(duì)照組，給予PPARβ／δ激動(dòng)劑GW0742大鼠三叉神經(jīng)頸復(fù)合體IL－6、ICAM－1、MMP－9表達(dá)強(qiáng)度下降（圖1）。

圖1 免疫組化法檢測(cè)大鼠腦干三叉神經(jīng)頸復(fù)合體PPARβ／δ、IL－6、ICAM－1及 MMP－9蛋白表達(dá)（SP染色法×100）

2．3 Western blot檢測(cè)

模型組大鼠三叉神經(jīng)頸復(fù)合體PPARβ／δ表達(dá)明顯高于生理鹽水對(duì)照組，GW0742組PPARβ／δ表達(dá)明顯高于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)模型組大鼠IL－6、ICAM－1及 MMP－9表達(dá)明顯高于生理鹽水組，給予PPARβ／δ激動(dòng)劑GW0742大鼠IL－6、ICAM－1及 MMP－9表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2、3）。

3 討論

圖2 Western bolt法檢測(cè)大鼠腦干三叉神經(jīng)頸復(fù)合體PPARβ／δ、IL－6、ICAM－1及 MMP－9蛋白表達(dá)

圖3 大鼠三叉神經(jīng)頸復(fù)合體PPARβ／δ、IL－6、ICAM－1及MMP－9蛋白表達(dá)（各組與參照密度值比值，ˉx±s，n＝24）

偏頭痛（migraine）是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。在偏頭痛發(fā)病機(jī)制的諸多學(xué)說中三叉神經(jīng)－血管反射學(xué)說占主導(dǎo)地位，越來越受到廣泛關(guān)注。偏頭痛的發(fā)生是由于某種原因激活了腦血管周圍的三叉神經(jīng)末梢，三叉神經(jīng)周圍血管纖維釋放血管活性肽等，使腦膜血管過度擴(kuò)張，血漿蛋白滲出，肥大細(xì)胞釋放組胺，引起硬膜和其他三叉神經(jīng)分布組織發(fā)生神經(jīng)源性炎癥，這種傷害性刺激沿著三叉神經(jīng)傳入纖維傳至三叉神經(jīng)核尾部，沖動(dòng)達(dá)到延腦化學(xué)感受區(qū)，引起惡心、嘔吐；傳入下丘腦，出現(xiàn)畏光癥狀，傳入大腦皮質(zhì)產(chǎn)生痛覺［6］。

過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferators－activated receptor，PPAR）是配體活化的核轉(zhuǎn)錄因子，其活化后能產(chǎn)生多種生物學(xué)作用，如調(diào)解脂質(zhì)代謝、提高胰島素敏感性和抗腫瘤作用等。PPAR 包括 PPARα、PPARβ／δ 和 PPARγ 三種亞型。在這三種亞型中，PPARα和PPARγ激動(dòng)劑的抗炎作用已通過大量研究證實(shí)，但是，另一種亞型PPARβ／δ的研究相對(duì)滯后，其作用還不十分清楚［6］。PPARβ／δ在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)最豐富，于各腦區(qū)神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞、腦血管內(nèi)皮和單核巨噬細(xì)胞等細(xì)胞均有表達(dá)［7］。

GW0742為 PPARβ／δ 的特異性激動(dòng)劑，與GW501516一起于2003年首次確認(rèn)［8］。鑒于偏頭痛時(shí)產(chǎn)生神經(jīng)源性炎癥，因此本實(shí)驗(yàn)研究偏頭痛時(shí)PPARβ／δ的表達(dá)及GW0742對(duì)偏頭痛的作用，對(duì)預(yù)防和治療偏頭痛可能具有十分重要的意義。

本實(shí)驗(yàn) 中偏頭 痛 模 型 組 中IL－6、ICAM－1 及MMP－9表達(dá)增強(qiáng)，PPARβ／δ表達(dá)上調(diào)。PPARβ／δ激 動(dòng) 劑 使 偏 頭 痛 鼠 炎 性 因 子 IL－6、ICAM－1 及MMP－9表達(dá)下調(diào)，提示PPARβ／δ在偏頭痛高度表達(dá)，PPARβ／δ激動(dòng)劑具有抗炎作用。Wahli W 等［9］研究表明PPARβ／δ可以推遲TNF－α等炎癥因子在損傷部位的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)細(xì)胞適應(yīng)應(yīng)激狀態(tài)，遠(yuǎn)離炎癥因子的凋亡信號(hào)，還能控制巨噬細(xì)胞的炎癥狀態(tài)。PPARβ／δ激動(dòng)劑可以強(qiáng)有力的減少INF－γ和LPS誘導(dǎo)的 TNF－α和IL－6及iNOS、COX2的表達(dá)上調(diào)［10］；給予 PPARβ／δ激動(dòng)劑后發(fā)現(xiàn) MCP－1、IL－1β的表達(dá)水平下降［11］。Northern blot分析發(fā)現(xiàn) MCP－1、IL－1β和 MMP－9是PPARβ／δ控制巨噬細(xì)胞炎癥的重要靶點(diǎn)。不僅如此，在之前作者的研究中已經(jīng)證實(shí)PPARβ／δ的抗炎性可以通過NF－κB途徑調(diào)節(jié)介導(dǎo)，使下游炎癥因子如IL－1、IL－6、TNF－a、ICAM－1表達(dá)減少，從而減少炎癥因子的啟動(dòng)，達(dá)到控制炎癥的作用［12］。本實(shí)驗(yàn)與上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，表明PPARβ／δ可能通過下調(diào)IL－6、ICAM－1 及 MMP－9等炎性因子表達(dá)而發(fā)揮抗炎作用［8－10］，同時(shí)也說明PPARβ／δ激動(dòng)劑GW0742通過抗炎機(jī)制對(duì)偏頭痛起保護(hù)作用。

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