綠色熒光蛋白和胰島素基因共表達重組腺病毒載體的構建及感染人臍帶間充質干細胞的實驗研究

惠 玲，劉 毅，宋 枚

間充質干細胞是一群具有多向分化潛能的多能干細胞，這些細胞能分化為脂肪細胞、肌細胞、骨和軟骨細胞等中胚層來源的細胞［1］。人骨髓間充質干細胞(human bone mesenchymal stem cells，hBMSCs)由于取材時需行骨髓穿刺，給患者帶來痛苦，限制了其在臨床的應用。人臍帶間充質干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs)可在體外分離、擴增、培養，被腺病毒高效感染，經誘導分化為脂肪細胞，是新的組織工程脂肪種子細胞。有報道表明，胰島素(insulin，INS)是前脂肪細胞轉化為成熟脂肪細胞的關鍵誘導因子之一［2-4］，但胰島素是否在多能干細胞的脂肪分化過程中發揮作用尚不清楚。本實驗構建含人胰島素基因的腺病毒載體，并將其感染進入hUCMSCs，利用增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)基因實現目的基因在體內外表達的示蹤定位，研究胰島素誘導干細胞脂肪分化的作用及機制，為今后組織工程脂肪的構建與體內回植研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 含胰島素基因的原始質粒、pShuttle-GFP-CMV穿梭質粒、pAdxsi重組腺病毒骨架載體、DH5α菌株(北京諾賽基因組研究中心有限公司);限制性內切酶(New England Biolabs公司，英國);T4 DNA連接酶(深圳晶美生物工程有限公司);小牛腸堿性磷酸酶單酯酶(calf intestinal alkaline phosphatase，CIP)、瓊脂糖(Promega公司，美國);Trizol、真核轉染試劑 Lipofectamine 2000(Invitrogen公司，美國);dNTPs(上海生工生物工程技術服務有限公司);DNA純化試劑盒(柱離心型)、DNA凝膠回收與純化試劑盒(柱離心型)、質粒小/中量提取純化試劑盒(北京威格拉斯生物技術有限公司);DNA Marker DL2000(大連寶生物工程有限公司);人胚腎細胞系HEK293細胞(HyClone公司，美國);CsCl2、DMEM培養基、LG-DMEM培養基、FBS、胰蛋白酶、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)(Sigma公司，美國);RT-PCR試劑(QiaGen公司，荷蘭)。

1.2 材料 蘭州軍區蘭州總醫院婦產科助產師于無菌條件下留取足月產兒富含膠質的臍帶20 cm，立即儲存于0．9%氯化鈉注射液中并及時處理。產婦均知情同意并得到醫院倫理委員會批準。

1.3 pShuttle-EGFP-INS重組穿梭質粒的構建與鑒定 將pShuttle-EGFP-CMV穿梭質粒用EcoRI/XhoI酶切，CIP去磷酸化處理，切膠回收5．1 kb載體片段。含目的基因胰島素的原始質粒用EcoRI/XhoI雙酶切，切膠回收約0．6 kb目的基因片段，將制備的穿梭質粒片段和胰島素片段用T4 DNA連接酶連接。取3 μl連接產物轉化DH5α感受態細菌，涂布到卡那抗性固體培養基，37℃培養箱中培養過夜。挑取單克隆菌落接種、擴增，提取質粒。提取的重組穿梭質粒用EcoRI/XhoI酶切，電泳鑒定。

1.4 pAdxsi-EGFP-INS重組腺病毒載體的構建 將pAdxsi載體用I-CeuI和I-SceI雙酶切后用CIP做去磷酸化處理，乙醇沉淀法回收;pShuttle-EGFP-INS質粒用I-CeuI和I-SceI雙酶切后膠回收EGFP-INS片段;將上述處理好的pAdxsi和EGFP-INS片段用T4 DNA連接酶連接，轉化DH5α感受態細菌，挑選單克隆菌落，提取質粒，用XhoI酶切電泳鑒定，鑒定正確后大量擴增重組腺病毒載體。

1.5 重組腺病毒載體的包裝、擴增及病毒滴度測定人胚腎細胞系HEK293細胞以5×105個/孔接種于6孔板中，次日，待細胞生長至底面積的80%～90%時，將鑒定正確的pAdxsi-EGFP-INS用PacI限制性內切酶線性化，用Lipofectamine 2000脂質體按其說明書進行轉染。當細胞大部分病變后，收集2個孔內的所有細胞及培養液于15 ml離心管中，在干冰、乙醇及37℃水浴反復凍融3次后，3000 r/min離心5 min，收集含病毒的上清液(pAdxsi-EGFP-INS第1代毒種P1)，棄沉淀。取2 ml P1代毒種繼續感染人胚腎細胞系HEK293細胞，病毒擴增2 d后將脫落的細胞連同培養液收入15 ml離心管中，2000 r/min離心5 min，棄上清，沉淀中加入1 ml ST buffer(含10%血清和2．5%甘油的 DMEM培養液)，渦旋混勻。按上述方法，凍融3次，－80℃保存待用。按此方法反復進行病毒擴增及收集。測定OD260，按照公式:VP/ml=OD260 ×1．1 ×1012，計算每毫升制品中病毒顆粒數，TCID50測定病毒滴度［5］。

1.6 pAdxsi-EGFP-INS感染hUCMSCs的初步研究

1.6.1 最適MOI值的篩選研究:原代培養并鑒定的hUCMSCs［6］傳至第3代時接種于96孔板中，每孔5000個細胞，設置5個濃度梯度，分別加入病毒上清 0、1、5、10、20 μl，37℃、5%CO2的培養箱培養，1 h后更換為完全培養基。分別于24、72 h通過熒光表達確定病毒的感染效率。

1.6.2 pAdxsi-EGFP-INS感染hUCMSCs及鑒定:實驗分兩組，將hUCMSCs以2×105個/孔接種于6孔板中，待細胞生長至85%融合時，按照最佳MOI值(100)分別加入含 pAdxsi-EGFP-INS(感染組)和pAdxsi-EGFP(對照組)的無血清 LG-DMEM 1 ml，37℃孵育6 h，期間每15分鐘震蕩細胞1次，6 h后加入1 ml含10%FBS的LG-DMEM，24 h后更換為含10%FBS的LG-DMEM。每天用熒光顯微鏡觀察熒光蛋白的表達。

1.6.3 qRT-PCR檢測胰島素基因表達:感染組及對照組細胞培養3 d后，應用Trizol法提取細胞總RNA，常規反轉錄為cDNA，設計INS引物:上游5'-AACACCTGTGCGGCTCTGAC-3'，下 游 5'-TTCCACAATGCCACGCTTCT-3'，內參基因GAPDH:上游5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，下 游 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。PCR 反 應 條 件:95℃、2 min，95℃、10 s，60℃、30 s，70℃、45 s，30 個循環。采用ΔΔCt的方法進行相對定量。

1.7 誘導hUCMSCs向脂肪細胞分化 將感染組和對照組hUCMSCs細胞以5×104個/孔的密度接種于12孔板，培養3 d后加入成脂誘導培養液，成脂誘導培養液為含10%FBS、地塞米松10－6mol/L、IBMX 0．5 mmol/L、吲哚美辛 60 μm/L、胰島素5 mg/L的LG-DMEM培養基，每3或4天換液1次，第18天采用油紅O染色，于倒置顯微鏡下觀察脂肪滴的形成情況。

2 結果

2.1 pAdxsi-EGFP-INS重組腺病毒載體的構建、鑒定及包裝 構建的pShuttle-EGFP-INS重組穿梭質粒，經 EcoRI/XhoI雙酶切電泳鑒定，在 0．6和5．1 kb可見2條帶(圖 1A)，其中 0．6 kb 條帶為含有目的基因胰島素的片段，與預期結果相同。將構建的pAdxsi-EGFP-INS重組腺病毒載體與pAdxsi空載體分別用XhoⅠ酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳觀察顯示，pAdxsi由以下 6 個條帶組成:14．0、11．8、4．0、2．47、1．45、0．60 kb(圖1B)，而 pAdxsi-EGFP-INS 由以下 7 個條帶組成:14．00、11．80、3．10、2．66、2．47、1．45、0．60 kb(圖 1C)，結果與預期序列分析相同。將pAdxsi-EGFP-INS用人胚腎細胞系HEK293細胞進行包裝，獲得的病毒進行擴增，用經典TCID50方法進行滴度測定，獲得的病毒滴度達到4×1011pfu/ml。

2.2 pAdxsi-EGFP-INS感染hUCMSCs最佳MOI值的確定及綠熒光蛋白表達情況 pAdxsi-EGFP-INS病毒感染hUCMSCs的最適MOI值約為100，感染效率＞95%。當MOI值＞100時，感染效率無明顯升高(圖2)。用最佳MOI值感染hUCMSCs后4 h，感染組及對照組細胞均可觀察到綠熒光蛋白表達，48～72 h后表達趨于穩定。兩組細胞形態無明顯差別，綠熒光蛋白在胞漿及胞核均有表達。qRTPCR檢測結果顯示感染組INS mRNA的表達量是對照組的431．29倍，表明感染的EGFP-INS在細胞內表達。

圖1 pAdxsi-EGFP-INS重組腺病毒載體的構建、鑒定

2.3 pAdxsi-EGFP-INS感染對hUCMSCs脂肪分化的影響 感染后1 d，2組均可觀察到大量的表達綠熒光蛋白的hUCMSCs(圖3A、B)，培養3 d后加入成脂誘導培養液，誘導3 d時2組細胞多為鋪展的不規則樣，相比誘導前細胞體積略有增大，熒光蛋白在胞漿及胞核均有分布(圖3C、D);誘導18 d，油紅O染色顯示2組細胞中有大量脂滴，對照組細胞中的脂滴相對集中，稍大，含有脂滴的脂肪樣細胞較少(圖3E)，而感染組細胞中的脂滴小而分散，含有脂滴的脂肪樣細胞明顯多于對照組(圖3F)。

圖2 pAdxsi-EGFP-INS感染人臍帶間充質干細胞不同MOI值的感染率（×100）

3 討論

hUCMSCs是多能干細胞，由于其易分離，傳代穩定，在體外可快速擴增，傳代后3～5 d能增殖4～5倍，傳代培養10代以上細胞可增殖510倍，且增殖速度無明顯降低，具有“橫向分化”或“跨系分化”的能力，可以在地塞米松、抗壞血酸、胰島素等不同誘導條件下，在體外分化為多種組織細胞(如神經細胞、脂肪細胞及心肌細胞等)而成為干細胞再生醫學及組織工程新的種子細胞之一［7-8］。

因為腺病毒可將自身的基因組遞送到細胞核中，并且高效率地復制，所以腺病毒成為表達和傳遞治療基因的主要候選者。腺病毒載體轉基因效率在體外實驗研究中接近100%，可轉導不同類型的人組織細胞，不受靶細胞是否為分裂細胞所限，進入細胞內并不整合到宿主細胞基因組，僅瞬間表達，安全性高。因而，腺病毒載體在基因治療臨床試驗方面有了越來越多的應用，成為繼反轉錄病毒載體之后廣泛應用且最具前景的病毒載體［9］。本實驗選用的pAdxsi-EGFP腺病毒系統是以Ad5血清型E1/E3缺陷型腺病毒DNA為骨架的復制缺陷型重組腺病毒系統，克隆陽性率高、滴度高，當MOI值為100時，攜帶綠色熒光蛋白基因的重組腺病毒體外感染hUCMSCs的效率可達到90%以上，能成功地將目的基因胰島素遞送到目標細胞。

胰島素是一種具有多種生物學效應的激素，除了可以調節葡萄糖轉運、脂代謝及肝糖原合成外，在細胞分化、細胞增殖、脂肪細胞脂滴積累、脂肪溶解調節等方面發揮重要作用［10-12］。Klemm 等［13］研究發現胰島素及其下游信號分子胰島素受體底物-1(IRS-1)、PI3K-Akt和CREB參與胰島素誘導的脂肪形成。胰島素通過與細胞膜上的胰島素受體結合誘導受體β亞單位的磷酸化并激活酪氨酸蛋白激酶，被激活的β亞單位進而使IRS-1酪氨酸殘基磷酸化，活化的IRS-1可與各種連接物蛋白結合，調節代謝，促進細胞生長增殖［14］。6種胰島素類似物對3T3-L1前脂肪細胞有不同程度的誘導分化，可以促進細胞向成熟脂肪細胞分化［15］，說明胰島素在脂肪細胞的成熟分化中有重要作用。同時也有研究報道，來源于骨髓基質細胞的前脂肪細胞株PA6向成熟脂肪細胞的分化不需要胰島素的誘導，但胰島素受體IR及IPS-1的mRNA在PA6細胞成脂分化中表達，胰島素可以誘導PA6細胞中脂肪分化相關蛋白Erks、Akt、p70的磷酸化，并促進2-脫氧－葡萄糖的吸收，提示脂肪形成過程中胰島素信號通路在骨髓來源的PA6細胞與髓外來源的脂肪細胞如(3T3-L1)不同［16］。

目前利用體外培養的細胞來研究脂肪細胞的分化機制主要集中于細胞的終末分化階段，但對于脂肪細胞決定前的分化調節機制仍不清楚。作為干細胞成脂分化中的一種重要的成脂誘導劑，胰島素在多能干細胞成脂分化中的作用尚不清楚。本研究構建了胰島素腺病毒表達載體并感染培養的hUCMSCs，并進行了初步的體外誘導成脂實驗，觀察到感染組hUCMSCs在成脂誘導劑誘導下分化為脂肪樣細胞，細胞中出現了大量的小脂滴，含有小脂滴的細胞數量多，而對照組hUCMSCs中的脂肪樣細胞數量少，細胞中的脂滴較大但量少，提示胰島素感染對干細胞的成脂分化有影響，但具體機制需進一步深入研究。在后續實驗中，我們還將攜帶有胰島素的hUCMSCs與可降解的生物支架材料(如PLGA等)聯合應用進行組織工程脂肪構建，研究移植細胞分泌的胰島素對移植細胞的成脂是否有促進作用。

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