四川奶牛腐蹄病主要病原菌調查

謝 晶，廖黨金，汪 明，何萬平，曹 冶，趙素君，曾 偉，李江凌，潘保良，葉勇剛，羅丹丹

（1．四川省畜牧科學研究院，四川 成都610066；2．中國農業大學動物醫學院，北京 海淀100193；3．四川省洪雅縣畜牧獸醫局，四川 洪雅620300；4．四川陽平種牛公司，四川 洪雅620300）

奶牛腐蹄病是奶牛場最常見的疫病之一，在我國各地都表現出較高的發病率，尤其是在我國南方，其高溫、高濕、集約化飼養等自然條件，奶牛場的腐蹄病更為嚴重。腐蹄病的發生引起奶牛產奶量下降，繁殖率，飼料報酬降低，治療成本增加，嚴重者常常導致奶牛過早淘汰，從而造成巨大的經濟損失。據統計，舍飼牛群中發病率高者可達到30%～40%，目前我國每年因腐蹄病被迫淘汰的奶牛占淘汰總數的15%～30%，給奶牛業造成經濟損失達2 250萬元［1］。關于牛腐蹄病的病原，一直存在著爭議，多數學者認為牛和綿羊感染性蹄病的主要病原體是壞死梭桿菌和節瘤擬桿菌，該病的發生主要是由壞死梭桿菌和節瘤擬桿菌共同感染而引起的，節瘤擬桿菌感染動物的蹄部之后，將其蹄部皮膚和基層的完整性破壞，為壞死梭桿菌對蹄部的侵入和感染創造了有利的條件，壞死梭桿菌感染表面損傷的蹄部后引起蹄部組織的化膿、壞死以及全身的病理變化。在腐蹄病病原中，除主要病原壞死梭桿菌和節瘤擬桿菌外，還有產黑色素擬桿菌，脆弱擬桿菌以及其他化膿壞死微生物區系，如產氣莢膜梭菌、金黃色葡萄球菌和化膿棒桿菌等并發感染。此外，螺旋體、糞彎桿菌、變形桿菌、球菌、酵母、微球菌［2－5］。

四川省奶牛養殖主要分布在成都、洪雅、南充、眉山、雅安、巴中、達州、西昌等大中城市郊區，養殖數量占全省養殖數量的80%左右。其中成都、洪雅、眉山等地地處四川盆地，屬于亞熱帶濕潤氣候，氣候溫和，雨量豐沛，5～9月份為降雨集中時段，降雨量占年總降雨量的85%左右，也是奶牛腐蹄病高發季節。在這種高溫高濕地區奶牛因患蹄病淘汰率高達31．8%，在管理較好的奶牛場，淘汰奶牛中因腐蹄病淘汰的奶牛約占15%。腐蹄病是四川奶牛養殖中常見疾病，是影響奶牛產奶質量主要原因之一，在規?；鲋饕捎昧蛩徙~浴蹄和抗生素治療［6－7］。由于不清楚感染性蹄病的主要致病菌類型和分布，在抗生素應用上存在很大盲目性，造成用藥成本高并存在藥物殘留的風險，開展奶牛腐蹄病病原調查和藥物敏感試驗研究為該地區奶牛腐蹄病的科學、有效的防治及奶牛養殖業的持續健康發展具有重要意義。

1 材料與方法

1．1 材料 牛肉膏，蛋白胨，葡萄糖，瓊脂粉，氯化血紅素，半胱氨酸等化學試劑為國產分析純。清潔型小鼠購自華西醫大。藥敏片購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1．2 臨床樣本采集 在洪雅、金堂、眉山、邛崍等8個規模在200頭以上的奶牛場進行奶牛腐蹄病樣本的采集。患蹄先經駐場獸醫修剪后，用無菌生理鹽水沖洗，用無菌活性炭棉拭子抹取患病部位，或無菌剪開化膿部位，用無菌活性炭棉拭子抹取深部膿汁，每個樣本采集3個棉拭子，一個立即放入已經還原的心腦浸液液體培養基試管，將試管放入玻璃干燥器內，厭氧處理后用凡士林密封干燥器，送回實驗室；第2個棉拭子放入滅菌營養肉湯培養基，送回實驗室；用第3個棉拭子將病料涂于載玻片上，干燥經火焰固定后帶回實驗室用革蘭染色法染色鏡檢，觀察細菌形態。

1．3 細菌的分離 將已經采集樣本的干燥器和肉湯培養基于37℃進行厭氧和需氧培養48～96h，沾取培養液轉接到心腦浸液固體培養基、卵黃培養基、營養肉湯培養基劃線培養，分別進行需氧和厭氧培養，分離單個菌落，根據細菌在不同培養基的菌落形態進行分類，對同一類型的單菌落挑取2～3個進行革蘭染色鏡檢，再將染色特性相似的歸類，并將單個菌落在液體培養基中擴大培養，制成20%甘油菌液于－20℃保存備用。

1．4 小鼠致病性試驗 將分離的厭氧菌單個菌落接種于心腦浸液培養基進行厭氧純培養，需氧菌單個菌落接種于營養肉湯培養基進行需氧純培養，勾取純培養物接種于相應的培養基培養24h，接種小鼠5只，每只腹腔注射0．2mL，觀察分離細菌對小鼠的致病性。對死亡小鼠進行剖檢，無菌采集肝臟、心血進行細菌的再分離培養，獲得的單個菌落進行擴大培養，并制備甘油菌于－20℃和液氮保存。另外，單個菌落進行革蘭染色鏡檢。

1．5 致病細菌鑒定 將對小鼠致病的細菌復壯，純培養物采用美國Biolog公司的Microstation儀器進行細菌鑒定。

1．6 藥敏試驗 采用紙片擴散法進行藥敏試驗。挑取分離病原菌純培養，單菌轉接至相應的液體培養基，吸取一定量過夜培養菌液涂布于相應的固體培養基，用無菌鑷子將臨床常用抗生素藥敏紙片分別貼于培養基表面，置37℃培養箱厭氧或需氧培養12～24h后，觀察并測定抑菌情況。

2 結果

2．1 致病細菌的分離和鑒定 棉拭子病料涂片革蘭染色鏡檢，均可觀察到不同細菌形態。共分離到細菌45株，經過小鼠致病性試驗，獲得致病性細菌20株，生化鑒定為大腸桿菌（11／20），壞死梭桿菌（4／20），普通變形桿菌（1／20），奇異變形桿菌（2／20）和一種梭狀芽孢桿菌（2／20）。其中，壞死梭桿菌致死小鼠注射部位形成干酪樣膿腫。各致病菌菌落形態以及鏡檢形態見表1。

表1 致病菌生長特性及形態特征

2．2 藥敏試驗結果 致病菌藥敏試驗結果（見表2）表明，奇異變形桿菌和普通變形桿菌對抗生素的敏感性類似，大腸桿菌分離株對抗生素的敏感性有所不同，壞死梭桿菌對林可霉素和潔霉素最敏感。

表2 致病菌藥敏試驗

3 討論

因為奶牛養殖地區、環境的不同，養殖衛生的不同，奶牛腐蹄病感染的病原微生物區系比較復雜。本試驗對四川主要奶牛養殖區進行了奶牛腐蹄病病原的調查，發現牛腐蹄病病原有大腸桿菌、壞死梭桿菌、奇異變形桿菌、普通變形桿菌和梭狀芽孢桿菌。大腸桿菌和變形桿菌屬是人和動物腸道的正常寄居菌，廣泛存在于泥土、水和糞污中，是人和動物感染的重要條件致病菌，且其感染具有持久性和難治性，因此，養殖環境的衛生條件控制至關重要。在分離病原菌時，由于采集的病料的方法和分離的不同，可能會造成一些條件致病菌在分離過程中丟失。另外，由于采樣的患病奶牛多已經進行過抗生素治療，在病料涂片鏡檢時8個奶牛場均觀察到典型的呈串珠狀或細長桿狀的壞死梭桿菌，但是在病原菌分離過程中卻只有很少機會分離到其單個菌落。本次分離到的梭桿菌屬芽孢桿菌在文獻中未見報道，有待進一步深入研究。

從藥敏試驗結果可知，分離的引起四川奶牛腐蹄病的病原菌對大多數抗菌藥物具有較好的敏感性，在臨床上多選用敏感、藥殘較低的藥物結合綜合防制措施進行治療。

［1］ 鄒靜．西昌市奶牛腐蹄病的診治［J］．畜禽業，2010，258：82－84．

［2］ 蘇曉健，趙永旺，徐小琴，等．牛腐蹄病病原微生物的分離鑒定［J］．黑龍江畜牧獸醫（科技版），2009，11：92－93．

［3］ Tan Z L，Nagaraja T G，Chengappa M M．Fusobacterium necrophorum infections：virulence factors，pathogenic mechanism and control measures［J］．Vet Res Commun，1996，20：113－140．

［4］ Nagaraja T G，Narayanan S K，Stewart G C，etal．Fusobacterium necrophorum infections in animals：pathogenesis and pathogenic mechanisms［J］．Anaerobe，2005，11：239－346．

［5］ Cruz C E F，Pescador C A，Nakajima Y，etal．Immunopathological investigations on bovine digital epidermitis［J］．The Veterinary Record，2005，157：834－840．

［6］ 周賢光．奶牛腐蹄病的防治［J］．四川畜牧獸醫，1993，（3）：39－40．

［7］ 廖黨金，汪明，謝晶，等．四川省荷斯坦奶牛疾病調查分析［J］．中國奶牛，2010，（2）：35－36．