貝類派琴蟲(chóng)二溫式PCR檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用

謝麗基，謝芝勛，劉加波，龐耀珊，鄧顯文，謝志勤，范 晴

（廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所 廣西畜禽疫苗新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧530001）

隨著海水養(yǎng)殖規(guī)模的日益擴(kuò)大及密度的持續(xù)增高，貝類的病害也頻繁出現(xiàn)，其中奧爾森派琴蟲(chóng)（Perkinsus olseni）感染的危害較大，在我國(guó)［1］、韓國(guó)［2］和日本［3］均有過(guò)報(bào)道。奧爾森派琴蟲(chóng)感染是海水養(yǎng)殖貝類最為常見(jiàn)的病害之一，可引起貝殼不能閉合，套膜收縮，性腺發(fā)育抑制，生長(zhǎng)緩慢，偶爾也會(huì)出現(xiàn)膿腫，死亡率可高達(dá)95%［4］。

目前派琴蟲(chóng)的檢測(cè)有雷氏液體巰基醋酸鹽培養(yǎng)基（RFTM）法和ELISA 方法等［1，5］。但這些方法均存在一定的局限性。RFTM方法缺乏專一性，檢測(cè)用時(shí)需7d以上，且只能檢測(cè)到派琴蟲(chóng)的休眠孢子，而ELISA檢測(cè)方法的敏感性較差。病原檢測(cè)、篩選建立無(wú)特定病原體的健康群，仍然是目前預(yù)防與控制派琴蟲(chóng)的最有效辦法。PCR方法具有操作簡(jiǎn)便、敏感性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，已成為檢測(cè)派琴蟲(chóng)的重要方法［6］。

二溫式聚合酶鏈反應(yīng)，即二溫式PCR，又稱雙溫PCR、或二溫度點(diǎn)法PCR和二溫度梯度PCR，是根據(jù)經(jīng)典PCR技術(shù)原理，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)PCR進(jìn)行改進(jìn)，將退火和延伸合并為一個(gè)溫度，比標(biāo)準(zhǔn)PCR的退火溫度高，提高了反應(yīng)的特異性，縮短了檢測(cè)時(shí)間［7－8］。近年來(lái)該方法應(yīng)用比較廣泛，主要用于水產(chǎn)品、哺乳動(dòng)物、禽類及植物中病原菌的快速檢測(cè)。目前國(guó)內(nèi)還未見(jiàn)有建立派琴蟲(chóng)二溫式PCR檢測(cè)方法的報(bào)道，本研究設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物，建立了派琴蟲(chóng)的二溫式PCR快速檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 PCR試劑盒及pMD18－T試劑盒，購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；DNA片段回收試劑盒和海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒，購(gòu)自廣州東盛生物科技有限公司。PCR儀為美國(guó)Perkin Elmer Cetus公司生產(chǎn)的PE9600儀。

1.2 病原體和質(zhì)粒DNA 派琴蟲(chóng)、單孢子蟲(chóng)、折光馬爾太蟲(chóng)、副溶血弧菌、溶藻弧菌和河弧菌等由本室保存；pMD－Perkinsus質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存［9］。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中派琴蟲(chóng)的保守序列，通過(guò)Blast驗(yàn)證，設(shè)計(jì)了1對(duì)特異性引物P276－1和 p276－2，擴(kuò)增大小為276bp。引物由TaKaRa公司合成，序列如下：

1.4 核酸抽提 取待檢貝類的鰓組織約100mg，勻漿后根據(jù)海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒的說(shuō)明書(shū)提取DNA。對(duì)病原體DNA的抽提按同樣方法進(jìn)行。

1.5 二溫式PCR擴(kuò)增介質(zhì)及各反應(yīng)條件的優(yōu)化在50μL的反應(yīng)體系中含：25mmol／L MgCl22.5 μL，10×PCR Buffer 5μL，10mmol／L dNTP 1 μL，Taq聚合酶5單位0.25μL，適當(dāng)濃度的上游引物和下游引物，模板1μL。以抽提的派琴蟲(chóng)DNA為模板，對(duì)二溫式PCR各循環(huán)參數(shù)和各引物濃度等進(jìn)行優(yōu)化，以確定最佳的二溫式PCR模式。

1.6 二溫式PCR特異性試驗(yàn) 對(duì)已提取的派琴蟲(chóng)、單孢子蟲(chóng)、折光馬爾太蟲(chóng)、副溶血弧菌、溶藻弧菌和河弧菌的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，檢驗(yàn)所建立的二溫式PCR的特異性。

1.7 二溫式PCR的敏感性 測(cè)定pMD－Perkinsus質(zhì)粒的含量后，按10倍遞增稀釋成10ng、1ng、100 pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg、0.1fg、0.01fg、0.001fg，分別加入到最佳的二溫式PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)模板的最低檢測(cè)量。

1.8 臨床樣品的檢測(cè) 應(yīng)用本研究所建立的二溫式PCR方法，對(duì)2012年采自廣西225份牡蠣、41份貽貝、40份文蛤，連云港的48份菲律賓蛤仔，溫州的102份溢蟶和58份血蛤進(jìn)行檢測(cè)。

1.9 二溫式PCR產(chǎn)物的電泳分析及克隆測(cè)序 對(duì)1.8中檢測(cè)為陽(yáng)性的牡蠣、菲律賓蛤仔和溢蟶，取50 μL二溫式PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，在紫外燈下用刀片切割所需的片段，然后用凝膠回收試劑盒純化回收。取適量純化回收的二溫式PCR產(chǎn)物，與pMD18－T于16℃連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化DH5α大腸埃希菌。挑取陽(yáng)性克隆菌送寶生物工程（大連）有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果進(jìn)行Blast比對(duì)分析。

2 結(jié)果

2.1 二溫式PCR條件優(yōu)化 通過(guò)對(duì)二溫式PCR的引物濃度、各反應(yīng)溫度、時(shí)間及循環(huán)次數(shù)等進(jìn)行優(yōu)化，最后確定二溫式PCR中P276－1和p276－2引物的最佳工作終濃度為0.3μmol／L，二溫式PCR的最佳反應(yīng)模式為94℃變性5min，然后進(jìn)入94℃變性30s，65℃退火30s，共進(jìn)行32個(gè)循環(huán)，最后再經(jīng)65℃延伸10min后，于4℃結(jié)束反應(yīng)。

2.2 二溫式PCR特異性擴(kuò)增結(jié)果 應(yīng)用最佳反應(yīng)體系，對(duì)派琴蟲(chóng)、單孢子蟲(chóng)、折光馬爾太蟲(chóng)、副溶血弧菌、溶藻弧菌和河弧菌的核酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果僅有派琴蟲(chóng)能擴(kuò)增出與試驗(yàn)設(shè)計(jì)大小相符的DNA擴(kuò)增帶；而其他對(duì)照病原體DNA在相同位置卻無(wú)任何DNA擴(kuò)增帶（圖1）。

圖1 二溫式PCR的特異性試驗(yàn)

2.3 二溫式PCR的敏感性擴(kuò)增結(jié)果 經(jīng)過(guò)敏感性測(cè)定，該二溫式PCR最低能檢出1fg的pMD－Perkinsus質(zhì)粒模板（圖2）。

圖2 敏感性試驗(yàn)

2.4 臨床樣品的檢測(cè) 應(yīng)用建立的二溫式PCR方法，對(duì)2012年采自廣西225份牡蠣、41份貽貝、40份文蛤，連云港的48份菲律賓蛤仔，溫州的102份溢蟶和58份血蛤進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果廣西的牡蠣檢出派琴蟲(chóng)27份，連云港的菲律賓蛤仔檢出派琴蟲(chóng)12份，溫州的溢蟶中檢出6份（部分檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3），而其他未檢出。

圖3 部分臨床樣品檢測(cè)的結(jié)果

2.5 測(cè)序結(jié)果與序列分析 經(jīng)測(cè)序結(jié)果分析及Blast比對(duì)分析，證明了牡蠣、菲律賓蛤仔和溢蟶的派琴蟲(chóng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，大小為276bp，與設(shè)計(jì)大小相符。PCR產(chǎn)物的核酸序列與引物設(shè)計(jì)模板的基因?qū)?yīng)片段的同源性一致。說(shuō)明本研究建立的二溫式PCR方法，適用于貝類派琴蟲(chóng)的檢測(cè)。

3 討論

一般PCR儀的升溫速度為4℃／s，68℃到80℃升溫時(shí)間約為3s；Taq DNA聚合酶活性最佳溫度為72℃，此溫度下的延伸速度為150bp／s～300bp／s，對(duì)于相對(duì)較短的DNA片段，可將退火、延伸溫度合并為一個(gè)溫度，在較短時(shí)間內(nèi)引物與模板退火結(jié)合已經(jīng)充分延伸形成產(chǎn)物片段，因此采用二溫式PCR能產(chǎn)生與三步PCR同樣多的產(chǎn)物。因此，本試驗(yàn)在設(shè)計(jì)引物時(shí)，有意識(shí)的提高了引物的Tm值，使引物與模板能準(zhǔn)確結(jié)合而且穩(wěn)定性好，以減少非特異擴(kuò)增。

本試驗(yàn)所建立的派琴蟲(chóng)二溫式PCR方法，具有操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)快速、敏感性高和特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，目前還未見(jiàn)有建立派琴蟲(chóng)二溫式PCR檢測(cè)方法的報(bào)道。本試驗(yàn)建立了派琴蟲(chóng)的二溫式PCR檢測(cè)方法，全程（包括核酸提取、二溫式PCR擴(kuò)增和電泳）僅需約5h，比常規(guī)PCR［10］檢測(cè)時(shí)間縮短1h。該二溫式PCR對(duì)派琴蟲(chóng)擴(kuò)增出與設(shè)計(jì)大小相符的276 bp條帶，而對(duì)其他5種病原體則均不能擴(kuò)增出任何條帶，具有很好的特異性；同時(shí)該二溫式PCR檢測(cè)方法的敏感性最低可檢測(cè)到1fg的pMD－Perkinsus模板，說(shuō)明該二溫式PCR檢測(cè)方法具有很高的敏感性，這對(duì)于在貝類派琴蟲(chóng)的發(fā)病早期提供準(zhǔn)確的診斷結(jié)果，切斷其傳播途徑有重要意義，同時(shí)也是選育建立無(wú)派琴蟲(chóng)病的健康貝類養(yǎng)殖群所必要的。

應(yīng)用建立的二溫式PCR方法，對(duì)2012年采自廣西225份牡蠣、41份貽貝、40份文蛤，連云港的48份菲律賓蛤仔，溫州的102份溢蟶和58份血蛤進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果廣西的牡蠣檢出派琴蟲(chóng)27份，連云港的菲律賓蛤仔檢出派琴蟲(chóng)12份，溫州的溢蟶中檢出6份，檢測(cè)結(jié)果表明，在廣西牡蠣、連云港的菲律賓蛤仔和溫州的溢蟶中存在派琴蟲(chóng)的感染，在國(guó)內(nèi)首次檢出溢蟶中存在派琴蟲(chóng)的感染，提示我們?cè)谪愵惖酿B(yǎng)殖中應(yīng)特別注意防治派琴蟲(chóng)的感染。

［1］Hine P M and Thorne T，Haplosporidium S P.（Alveolata：Haplosporidia）associated with mortalities among rock oysters Saccostrea cuccullata in north Western Australia［J］.Dis Aquat Organ，2002，51（2）：123－33.

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［6］謝麗基，謝芝勛，龐耀珊，等.貝類單孢子蟲(chóng)PCR檢測(cè)方法的建立［J］.中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2010（1）：54－56.

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