復(fù)方痢菌凈搽劑的制備及初步安全性穩(wěn)定性考察

陳紅偉，林永樂，吳俊偉，劉 娟，魏述永，張志強

（西南大學(xué)榮昌校區(qū)動物醫(yī)學(xué)系，重慶 榮昌402460）

痢菌凈，又稱乙酰甲喹，是近年來經(jīng)篩選確認(rèn)有臨床實用價值的獸用抗菌劑，對多數(shù)細(xì)菌有較強的抑制作用，對革蘭陰性菌作用更強，對仔豬黃、白痢有效［1］。鹽酸左旋咪唑為廣譜、低毒驅(qū)線蟲藥，并有一定的免疫增強作用，臨床上應(yīng)用較為廣泛［2］。本試驗首次將非特異性免疫調(diào)節(jié)劑、驅(qū)蟲藥－左旋咪唑與當(dāng)前防治仔豬腸型大腸桿菌病安全有效的藥物－

痢菌凈聯(lián)合應(yīng)用制備成透皮吸收制劑，臨床用于防治仔豬大腸桿菌病并兼具驅(qū)蟲作用，現(xiàn)將其制備工藝和初步安全性、穩(wěn)定性考察報告如下。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 儀器 紫外檢測儀（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；ZTY智能透皮擴(kuò)散試驗儀TP2A（鞏義市英峪予華儀器廠）；WZZ－2A2B自動旋光儀（河南兄弟儀器設(shè)備有限公司）；JD100－3型電子天平（沈陽龍騰電子有限公司）等。

1．1．2 試藥 痢菌凈精制原料（含量：99．6%）、鹽酸左旋咪唑精制原料（含量：99．7%）（均由重慶布爾動物藥業(yè)有限公司惠贈）；氮酮（分析純，福建壽寧美菲思生物化學(xué)品廠）；苯甲醇（分析純，成都科龍化工試劑廠）；1，2－丙二醇（分析純，重慶東方試劑總廠）等。

1．1．3 試驗動物 昆明系小鼠，體重18～22g，新西蘭白兔，2．2±0．2kg體重，由西南大學(xué)榮昌校區(qū)實驗動物中心提供。

1．2 方法

1．2．1 體外透皮試驗方法［3］采用Franz擴(kuò)散裝置（ZTY智能透皮擴(kuò)散試驗儀），將經(jīng)預(yù)處理的小鼠的皮膚固定在滲透擴(kuò)散裝置的擴(kuò)散池與接受池之間，皮膚內(nèi)層面向接受池，然后將復(fù)方痢菌凈搽劑樣品充滿整個擴(kuò)散池。在接受池中充滿接受液并密閉封存，接受液溫度維持在32℃±0．5℃。每次取樣后均補加相同體積的新鮮接收液并排除接受室中的氣泡，樣液分別采用紫外分光光度法測定痢菌凈濃度，用旋光法測定鹽酸左旋咪唑濃度，并按如下公式分別計算其累積滲透量（Q）。

注：式中Q為單位面積累積透過量，A為透皮擴(kuò)散面積，V為Franz擴(kuò)散池接受室體積，Cn為第n次取樣時接受液的濃度，Ci為第i次取樣時接受液的濃度，Vi為取樣量。

以單位面積累積滲透量Q對時間t進(jìn)行線性回歸所得方程即為Higuchi方程，所得斜率K即為透皮速率常數(shù)［單位為（μg／cm2·h）］。

1．2．2 藥物含量檢測方法

1．2．2．1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取痢菌凈，用二甲基甲酰胺、鹽酸溶解制得濃度為1、4、8、12、16、20 μg／mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用紫外檢測儀測定其吸光度A（檢測波長為381nm）［4］。以吸光度 A值（Y）對相應(yīng)的痢菌凈濃度（X）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為：Y＝0．0559X－0．0104，R2＝0．9999（n＝5）。說明，痢菌凈在1～20μg／mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

另精密稱取鹽酸左旋咪唑，用接收液制成1、5、10、15、20、25、30mg／mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定其旋光度［5］（采用鈉光譜D線，波長為589．3nm，管長度2dm，在20±0．5℃測定）。以旋光度值（Y′）對相應(yīng)的鹽酸左旋咪唑濃度（X′）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為：Y′＝－0．1128X′－0．0097，R2＝0．999 9（n＝5）。說明，鹽酸左旋咪唑在1～30mg／mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

1．2．2．2 回收率、變異系數(shù)、專屬性檢查［6］以4、12、20μg／mL 3個添加濃度（n＝3）測定痢菌凈的回收率分別為97．85%、101．22%、98．97%，日內(nèi)變異系數(shù)分別為2．21%、1．74%和1．81%，日間變異系數(shù)分別為3．44%、2．13%和 2．34%；以 5、15、25 mg／mL 3個添加濃度（n＝3）測定鹽酸左旋咪唑的回收率分別為99．45%、102．32%、101．47%，日內(nèi)變異系數(shù)分別為2．13%、1．65%和1．14%，日間變異系數(shù)分別為1．94%、2．06%和1．32%。另外，進(jìn)行了兩種藥物之間以及與輔料間的專屬檢查，均符合要求，表明所建立的測定方法準(zhǔn)確度、精密度、專屬性均良好，滿足試驗要求。

1．2．3 正交試驗設(shè)計 結(jié)合預(yù)試驗，以4%痢菌凈、7．5%鹽酸左旋咪唑以及適量助溶劑為處方基礎(chǔ)，選擇氮酮（A）、苯甲醇（B）、丙二醇（C）、乙醇（D）4種輔料為可變因素，各取3個水平，采用L9（34）正交試驗篩選透皮劑處方。按1．2．1中要求進(jìn)行體外透皮試驗，于1、2、4、6、8、10h取樣，用紫外分析儀檢測痢菌凈含量，用旋光儀檢測鹽酸左旋咪唑含量，計算單位面積累積滲透量（Q），透皮速率（J），并以J為指標(biāo)進(jìn)行處方篩選。

1．2．4 工藝驗證 將優(yōu)化篩選出的處方制備3批樣品，進(jìn)行體外透皮試驗，測定其透皮速率常數(shù)（J），最后確定該透皮劑最佳配方。

1．2．5 初步穩(wěn)定性試驗［7］溫度加速試驗：取3批樣品，置于溫度40℃±2℃、相對濕度為75%±5%密閉避光的容器中6個月，分別于0、1、3、6月末抽樣檢測1次，對性狀、含量、澄明度等進(jìn)行檢測并記錄。

光照加速試驗：將3批樣品置于光照箱中照射，定時翻動樣品，在25℃±2℃，照度4500LX±500LX的條件下，放置10d，于第5天和第10天分別取出部分樣品，對性狀、含量、澄明度等進(jìn)行檢測并記錄。

低溫冷藏試驗：取3批樣品，置于4℃冰箱中冷藏6個月，每月末抽樣檢測1次，對性狀、含量、澄明度等進(jìn)行檢測并記錄，重點觀察有無結(jié)晶析出。

1．2．6 初步安全性考察

1．2．6．1 皮膚刺激性試驗［8］選健康無傷的白色家兔6只，試驗采用同體的左右側(cè)自身對比的方法，分為兩組。完整皮膚組按照1mL／只的劑量在左側(cè)去毛區(qū)涂搽試藥，右側(cè)去毛區(qū)涂生理鹽水。破損皮膚組將去毛皮膚消毒并用針劃井字形，以滲血為度，按照1mL／只的劑量在左側(cè)滲血區(qū)涂搽試藥，右側(cè)去毛區(qū)生理鹽水作對照。用醫(yī)用紗布，膠帶加以固定。每只兔子分籠飼養(yǎng)，給藥24h后，用溫水洗去殘留的試藥，每隔24h觀察1次去毛處皮膚有無紅斑和水腫情況。連續(xù)觀察7d并記錄。參考文獻(xiàn)［8］進(jìn)行評分并判斷結(jié)果。

1．2．6．2 皮膚過敏試驗［8］另選健康無傷的白色家兔6只，分為兩組。第1組給復(fù)方痢菌凈搽劑0．2mL只，第2組陽性對照（1%2．4－二硝基氯代苯）0．2mL／只。將受試藥物（或陽性對照物）涂于家兔左側(cè)去毛區(qū)域，用無刺激性的紗布和膠帶覆蓋、固定。每只家兔分籠飼養(yǎng)，持續(xù)6h，隔日致敏1次，共計3次。在末次致敏14d后，再進(jìn)行激發(fā)接觸，在背部右側(cè)去毛區(qū)皮膚上，同上操作，6h后去除供試品。立刻觀察，并于24、48、72h后觀察有無過敏反應(yīng)。參考文獻(xiàn)記錄各時間過敏反應(yīng)值，計算過敏率并評價藥物的致敏性［8］。

1．2．6．3 急性皮膚毒性試驗［9］另選健康無傷的白色家兔9只，分為3組。高劑量組按3mL／只試液均勻涂于去毛區(qū)，低劑量組按1mL／只試液均勻涂于去毛區(qū)。對照組按2mL／只涂生理鹽水。用醫(yī)用紗布覆蓋，并用無刺激的膠帶加以固定，兔子分籠飼養(yǎng)。24h后用溫水洗去殘留受試藥物。每隔24 h觀察1次家兔的皮膚及四肢的活動狀況，并記錄心率，呼吸頻率，飲食，飲水狀況，連續(xù)觀察7d。

2 結(jié)果與分析

2．1 正交試驗結(jié)果 見表1。

經(jīng)方差分析P＞0．05，差異不顯著，由直觀級差分析可知：以痢菌凈透皮速率常數(shù)J級差R為評價指標(biāo)，各種因素的影響大小為B＞A＞D＞C；以鹽酸左旋咪唑透皮速率常數(shù)J級差R′為評價指標(biāo)，各種因素的影響大小為A＞B＞C＞D；綜合級差R＋R′，各種因素的影響大小為B＞A＞D＞C。兩項指標(biāo)均表明A1B3C2D3為最佳工藝，即2．5%氮酮、14%苯甲醇、10%丙二醇、40%乙醇。

2．2 工藝驗證 按照優(yōu)化選定的處方制備3批樣品，進(jìn)行體外透皮試驗，痢菌凈透皮速率常數(shù)（J）平均值為8．10mg／cm2·h，鹽酸左旋咪唑透皮速率常數(shù)（J′）平均值為17．65mg／cm2·h，均顯著優(yōu)于樣品。2．3 初步穩(wěn)定性試驗 溫度加速試驗：3批樣品第6月末痢菌凈含量分別平均下降了2．69%（n＝3），鹽酸左旋咪唑平均下降了1．69%（n＝3），各樣品均為淺黃色澄明液體。

光照加速試驗：3批樣品包裝組光照10d痢菌凈含量平均下降了1．70%（n＝3），鹽酸左旋咪唑平均下降了0．71%（n＝3）；裸露組痢菌凈含量平均下降了5．84%（n＝3），鹽酸左旋咪唑平均下降了1．02%（n＝3）。包裝組為淺黃色澄明液體，裸露組為紅棕色液體。

低溫冷藏試驗：3批樣品第6個月末痢菌凈含量平均下降了0．82%（n＝3），鹽酸左旋咪唑平均下降了0．58%（n＝3），各樣品均為淺黃色澄明液體，未見析出。

結(jié)果表明，該工藝條件下該制劑穩(wěn)定性較好，光照加速試驗結(jié)果提示需避光保存。

2．4 初步安全性試驗 皮膚刺激性試驗、皮膚過敏性試驗、急性皮膚毒性試驗的結(jié)果分別見表2～表4。

表1 正交試驗

表2 復(fù)方痢菌凈搽劑對家兔的刺激性試驗

表3 復(fù)方痢菌凈搽劑對家兔的致敏反映

表4 復(fù)方痢菌凈搽劑對家兔的急性皮膚毒性試驗

從表2～表4結(jié)果表明，該工藝制備的復(fù)方痢菌凈搽劑無皮膚刺激性、無皮膚過敏性、無急性皮膚毒性。

3 討論

大腸桿菌病是仔豬常見的消化道疾病，也是導(dǎo)致仔豬死亡的主要原因之一。目前對該類病的防治，主要包括菌苗免疫和藥物防治。但由于因腸道微生物抗原和抗原決定簇復(fù)雜，免疫機(jī)制略有差異，免疫效果常不確切；另外，在應(yīng)用藥物防治過程中，臨床上經(jīng)常使用的藥物由于長期應(yīng)用往往療效不佳，而一些常用劑型如粉散劑、注射劑等，或因采食量下降導(dǎo)致給藥劑量不確實，或引起仔豬應(yīng)激，導(dǎo)致本已降低的仔豬免疫力更為低下，因此均有其缺陷。搽劑亦稱透皮劑，屬于經(jīng)皮給藥系統(tǒng)。可繞過肝臟的首過效應(yīng)，提高藥物的生物利用度。同時，可避免內(nèi)服藥物對胃腸刺激及生理功能的干擾，使毒副反應(yīng)減輕。另外，可減少應(yīng)用傳統(tǒng)劑型所引起的仔豬應(yīng)激，提高仔豬抵抗力，節(jié)省人力物力［10］。

痢菌凈和鹽酸左旋咪唑的透皮制劑均有文獻(xiàn)報道［1－2］，但將二者聯(lián)合制備成復(fù)方透皮制劑還未見報道，該制劑可用于防治仔豬大腸桿菌病并兼具驅(qū)蟲作用。筆者曾將該制劑作為科研試驗品在某豬場取得了不錯療效，但因穩(wěn)定性較差，特此進(jìn)一步進(jìn)行處方優(yōu)化和穩(wěn)定性考察。處方中選取苯甲醇、丙二醇、乙醇為混合溶媒，以提高主要藥物的溶解度。另外，透皮效率是透皮劑能否發(fā)揮療效的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，輔料中氮酮、丙二醇均為常見的透皮促進(jìn)劑，本研究結(jié)合預(yù)試驗以透皮速率常數(shù)為重要考察指標(biāo)，兼顧累積透過量和穩(wěn)定性，采用正交設(shè)計對處方進(jìn)行了優(yōu)化。最終確定復(fù)方痢菌凈透皮劑的處方組成主要為：4%痢菌凈、7．5%鹽酸左旋咪唑、2．5%氮酮、14%苯甲醇、10%丙二醇、40%乙醇。根據(jù)優(yōu)化處方制備的復(fù)方痢菌凈搽劑穩(wěn)定性好，無皮膚刺激性，含量測定方法簡便，質(zhì)量控制方法可靠。但為了最終研制出復(fù)方痢菌凈透皮劑，還需結(jié)合臨床試驗對處方進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。

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