替來他明—唑拉西泮合劑對大鼠腦皮質突觸體鈣動力學的影響

石星星，尹柏雙，2，李小波，李志強，王洪斌

（1．東北農業大學動物醫學學院，黑龍江 哈爾濱150030；2．吉林農業科技學院動物醫學學院，吉林 吉林132101）

鈣離子（Ca2＋）是維持機體細胞正常生理功能的重要離子，作為第二信使傳遞信息并調控一系列生命過程，如基因轉錄，蛋白質的合成與分解，細胞的生長等［1］。許多研究表明，鈣離子通過電壓門控鈣通道內流引起突觸體［Ca2＋］i增加，觸發神經遞質的釋放［2］。替來他明為苯環己哌啶類靜脈全身麻醉藥，唑拉西泮是苯二氮卓類鎮靜劑，將其1∶1復合制成Zoletil（歐洲）或 Telazol（美國）［3］，國外廣泛應用于動物的麻醉［4］，其麻醉機理尚不完全清楚。范宏剛研究表明，隨著替來他明劑量的增加，丘腦和小腦Ca2＋－Mg2＋－ATP酶活性呈現出劑量依賴性抑制的趨勢［5］，提示其麻醉作用可能與中樞神經系統鈣穩態有關。本試驗通過研究替來他明－唑拉西泮合劑對大鼠大腦皮質突觸體鈣動力學的影響，探討替來他明－唑拉西泮合劑麻醉與突觸體鈣離子的關系，探究該藥物的部分全麻分子機理。

1 材料與方法

1．1 試驗材料及動物 替來他明－唑拉西泮，購自法國維克制藥公司；Fluo－3－AM，購自 Molecular Probes公司；Triton X－100，購自碧云天生物技術研究所。SD純種大鼠6只，雌雄兼備，體重220±20 g，12～15周齡，購自哈爾濱市漢方實驗鼠類養殖所。

1．2 試驗分組 試驗分為對照組、低濃度藥物組（替來他明－唑拉西泮合劑終濃度為100μmol／L）、中濃度藥物組（替來他明－唑拉西泮合劑終濃度為200μmol／L）、高濃度藥物組（替來他明－唑拉西泮合劑終濃度為400μmol／L）。

1．3 突觸體的制備 參照Gray和Whittaker的方法［14］，略作修改。簡述之，取SD大鼠消毒，斷頭處死后迅速分離大腦皮質于勻漿器中，按1∶10（W／V）的比例加入預冷（4℃）的0．32mol／L蔗糖溶液并勻漿。勻漿液1 500r／min離心10min。取上清液緩慢滴加在2mL預冷的1．2mol／L蔗糖溶液表面，9 000r／min離心20min。緩慢吸取含有突觸體的中間梯度帶，用0．32mol／L蔗糖溶液稀釋3～3．5倍后滴加在8mL預冷的0．8mol／L蔗糖溶液表面，9 000r／min離心25min。吸取下層液相，加入等體積預冷的人工腦脊液后20 000r／min離心10 min，棄上清，沉淀用預冷的人工腦脊液重懸，放入4℃待用。

1．4 Fluo－3－AM負載 將制備的突觸體懸浮于人工腦脊液1h后加入鈣熒光指示劑Fluo－3－AM（終濃度為5μmol／L），37℃，避光恒溫振蕩30min。孵育負載后用人工腦脊液洗滌3次，室溫放置15 min，確保AM體的完全去酯化作用。

1．5 突觸體［Ca2＋］i的檢測 采用熒光分光光度計檢測，激發光488nm，發射光530nm。測樣品熒光值F，再加入終濃度為0．1%Triton X－100測熒光值Fmax，加入終濃度為5mmol／L的EGTA測熒光值Fmin，按以下公式求出［Ca2＋］，［Ca2＋］＝iiKd× ［（F－Fmin）／（Fmax－F）］，Kd為400nmol／L。1．6 統計分析 試驗數據以均數±標準差（±SD）表示，用SPSS 13．0軟件對試驗數據進行統計分析，組間比較采用t檢驗。

2 結果

結果見表1所示。加入替來他明－唑拉西泮合劑后，突觸體內游離鈣離子濃度顯著升高，與對照組比較差異極顯著（P＜0．01）；隨著替來他明－唑拉西泮合劑濃度的增加，突觸體內游離鈣離子濃度逐漸升高；高濃度組中突觸體內游離鈣離子濃度明顯高于中、低濃度組，差異顯著（P＜0．05）；中濃度組與低濃度組間比較差異不顯著（P＞0．05）。

3 討論

鈣離子在神經元內有發動動作電位、節律性發放、突觸的生長、基因表達和遞質釋放等多種功能。鈣離子通過電壓門控鈣通道進入突觸前神經末梢引起［Ca2＋］i增加，是調控神經遞質釋放的關鍵環節。具有完整膜結構的突觸體是目前麻醉藥對突觸前作用的良好研究模型。

表1 替來他明－唑拉西泮合劑對大鼠腦皮質突觸體鈣離子濃度的影響 （±SD，n＝6）

表1 替來他明－唑拉西泮合劑對大鼠腦皮質突觸體鈣離子濃度的影響 （±SD，n＝6）

##：藥物組與對照組比較差異極顯著（P＜0．01）；＊：藥物合劑組間比較差異顯著（P＜0．05）

組別 ［Ca2＋ ］i（nmol／L）對照組647．62±3．54合劑低劑量組 834．25±11．88##合劑中劑量組 839．44±15．49##合劑高劑量組 1 061．77±10．17##＊

近年來有關麻醉劑和突觸鈣離子關系的報道結果不一。張軍（2005）利用依托咪酯研究表明，依托咪酯對KCl誘發突觸體內鈣離子升高的抑制程度呈濃度依賴性［6］。Ito（2011）等認為，異丙酚和苯巴比妥可抑制興奮性突觸前鈣離子的增加，從而影響其神經遞質的釋放［2］。Fang（1998）對大鼠大腦皮層游離神經元末梢的研究表明，吸入麻醉藥異氟醚和氟烷影響突觸前鈣離子動力學，抑制鈣離子通道，而導致Ca2＋濃度降低［7］。王金波等（2001）研究報道，異丙酚和異氟醚作用于心肌細胞膜上的L－型鈣離子通道，抑制鈣離子跨膜內流，對心肌收縮性產生不同程度的影響［8］。國內外尚未發現有關替來他明及唑拉西泮和突觸體內鈣離子濃度關系的文獻報道。有少量關于替來他明及唑拉西泮和神經遞質關系的研究。如張燕［9］的研究發現，替來他明引起大腦皮層抑制性神經遞質γ－氨基丁酸（GABA）含量顯著升高。Chaudhary等（2003）認為唑拉西泮能促進GABA 的釋放［10］。

本試驗研究結果表明，替來他明－唑拉西泮合劑使鈣離子內流引起突觸體內鈣離子濃度升高，鈣離子作用于突觸囊泡促使抑制性神經遞質（GABA、Gly）釋放增加，降低突觸后神經元的興奮性，發揮抑制效應，使替來他明－唑拉西泮合劑產生全麻作用。

4 結論

試驗結果表明，替來他明－唑拉西泮合劑引起大鼠腦神經突觸間隙鈣離子內流使突觸體內鈣離子濃度升高，作為第二信使傳遞麻醉信息，促使突觸囊泡釋放抑制性神經遞質可能是其產生全麻作用的機理之一。

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［9］ 張燕．噻環乙胺及小型豬復合麻醉劑（XFM）對大鼠不同腦區神經遞質含量的影響［D］．哈爾濱：東北農業大學，2010：6，67．

［10］Chaudhary V，Hansen R，Lindgren H，etal．Effects of telazol and nembutal on retinal responses［J］．Doc Ophthalmol，2003，107（1）：45－51．