華南地區致病性豬大腸桿菌的鑒定和血清型分布

王文豪，蘇丹萍，張丹琳，申翰欽，張顯浩，陳瑞愛，，賀東生，

（1．華南農業大學獸醫學院，廣東 廣州510642；2．廣東省獸用生物制品技術研究與應用企業重點實驗室，廣東 肇慶526238）

豬大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌引起的豬腸道傳染性疾病，其主要危害1月齡以內的仔豬。根據發病日齡及臨床癥狀可分為仔豬黃痢、仔豬白痢和仔豬水腫3種。該病的發病率與死亡率均很高，給我國的養豬業帶來極大的危害。由于大腸桿菌的血清型眾多且各疫苗之間交叉免疫保護力低下，預防該病時一定要選擇適合當地流行的優勢菌株制備的疫苗進行免疫接種，才能起到事半功倍的效果。為了解華南地區豬大腸桿菌病流行情況及其優勢血清型的分布情況，以便為該病的防控提供理論依據，我們進行了此項觀察，報告如下。

1 材料與方法

1．1 病料 分別來自廣東、廣西、江西、湖南、福建、海南7個地區的38家豬場病豬的肝臟、脾臟、腸系膜淋巴結等組織。

1．2 主要試劑和培養基 營養肉湯、營養瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板、伊紅美藍平板，均購自北京普博欣生物科技有限責任公司；藥敏紙片及生化試劑，購自杭州天和微生物試劑有限公司；47種大腸桿菌標準O抗原單價血清，購自中國獸醫藥品監察所；昆明系SPF小鼠，購自廣州中醫藥大學。

1．3 大腸桿菌的分離培養 用接種環無菌采取病料于麥康凱平板上劃線培養，37℃培養18～24h，挑取單個粉紅色菌落于伊紅美藍培養基上，37℃培養24h，取伊紅美藍上具有金屬光澤的單個菌落涂片染色鏡檢。

1．4 生化試驗 按常規方法對分離的74株細菌進行葡萄糖、麥芽糖、硝酸鹽、乳糖、靛基質、M．R、蔗糖、明膠、V－P等12項生化指標測定［1］，觀察并記錄試驗結果。

1．5 大腸桿菌血清型鑒定 挑取經分離培養、形態特點、生化鑒定為大腸桿菌的單菌落，接種到肉湯培養基中，37℃培養18h。把菌液轉移至5mL的離心管中，5 000r／min離心10min；去上清，沉淀用4 mL生理鹽水振蕩混勻，5 000r／min離心10min；重復洗滌3次后去上清，沉淀用1．5mL生理鹽水振蕩混勻，制成濃稠菌懸液，121℃高壓2h，破壞細菌K抗原［2］。待菌懸液冷卻后，取25μL抗原與25μL稀釋的血清與潔凈的玻璃板上混勻，如1～3 min內出現明顯凝集現象可判定為陽性，同時用無菌生理鹽水與血清混合作對照，觀察細菌有無自凝現象［3］。

1．6 小鼠致病性試驗 從優勢血清型中選取18株大腸桿菌分別接種普通肉湯，37℃培養18h。稀釋細菌到109CFU／mL后經腹腔注射小鼠，每株菌注射4只，每只0．2mL；另4只作為陰性對照，腹腔注射0．2mL新鮮肉湯，觀察小鼠的發病死亡情況并對死亡小鼠剖檢觀察，無菌采取死亡鼠的肝臟組織接種于麥康凱瓊脂平板上，37℃培養18～24h后對分離到的細菌重新鑒定。判斷標準：致死4只或3只小鼠的為強毒株；2只的為中毒株；1只的為低毒株；不致死的為無毒株［4］。

2 結果

2．1 細菌的分離培養 從病料中分離到的74株細菌在麥康凱培養基上呈粉紅色，菌落中心呈深桃紅色，圓形，扁平，邊緣整齊，表面光滑濕潤。在伊紅美藍平板上長出有金屬光澤的紫色菌落。這些菌落經革蘭染色后在顯微鏡下均為兩端鈍圓的革蘭陰性菌。

2．2 生化試驗 74株分離菌經生化試驗結果均符合大腸桿菌的生化鑒定特征，見表1。

2．3 O抗原血清型鑒定 由玻板凝集試驗可知，74株大腸桿菌分離菌中的66株分屬于14個血清型，優勢血清型為 O107、O101、O9、O60、O26，占分離株的70．3%，另有8株未定型，占分離株的10．8%。見表2。

2．4 毒力試驗 從優勢血清型 O107、O101、O9、O60、O26中選出18株代表菌株進行小鼠毒力試驗發現，18株菌株中有7株強毒株，7株中等毒力株，2株低毒株，2株無毒株。見表3。

表1 分離菌株的生化鑒定

表2 華南地區大腸桿菌分離株血清型鑒定

表3 優勢血清型菌株的毒力試驗

3 討論

本文對華南地區大豬場，尤其是發病豬內臟器官（菌血癥）的致病性大腸桿菌的血清型進行分離和鑒定。在鑒定過程中，發現有些菌株的O抗原能夠與多個單因子血清進行凝集反應，這和黃炯［5］、陶勇［6］報道的一致。在凝集試驗中我們還發現，來源不同的菌株在出現與多個單因子血清都有凝集反應時，每次出現凝集反應的那幾個單因子血清種類基本上是相同的。此外，需要注意的是，當有單因子血清O101與O107、O117等血清同時與某一菌株反應時，O101血清的凝集反應現象總是最為明顯。同時在O101沒有出現凝集反應，而O107與O117、O131等其他血清同時與某一菌株反應時，O107的反應程度通常是最大的。推測發生這種現象的菌株可能存在多種表面抗原，且這些表面抗原具有某種共同的特性。目前對于大腸桿菌的分型主要是通過血清型鑒定來實現的，能否在血清型鑒定的基礎上站在共性抗原這個角度對大腸桿菌進行進一步分類值得考慮。

豬場中致病性大腸桿菌的優勢血清型在不同地區和不同時間會有改變。各血清型之間不但具有區域差異性，而且就算是在同一地區隨著時間的變化血清型也會隨之變化。高云英等在2005年曾報道，陜西省豬大腸桿菌流行的優勢血清型為O139、O101、O149、O141、O60［7］。陳祥等于2008年對華東地區部分豬場血清型鑒定后發現，O149、O107、O139、O93和O91是該地區流行的優勢血清型［8］。不僅如此，1998年，姜衛東等曾報道，O119、O60、O75、O141、O20、O8和O101為廣東省豬大腸桿菌流行的優勢血清型［9］。10余年后，2010年蘇丹萍等再次對廣東地區豬大腸桿菌分離鑒定后，發現血清型O138、O9為該地區流行的優勢血清型［10］。而這些都與華南地區豬大腸桿菌優勢血清型 O107、O101、O9、O60、O26有一定的差別。在本試驗定型的66株大腸桿菌中有14種血清型，另有8株未定型，這8株菌株是否屬于47種主要血清型之外或是新流行的其他血清型尚待進一步研究。在華南地區各省份各豬場之間大腸桿菌血清型分布差異也較大，甚至同一豬場也有幾種血清型菌株同時存在，因此必須定期對豬場的大腸桿菌進行血清型鑒定，從而研制血清型針對性強的疫苗才是防控該病的關鍵。本試驗從定型的菌株中選出5種18株優勢血清型菌株進行毒力試驗，毒力試驗結果表明，在5種優勢菌株中均可以找到較強毒力的菌株。本試驗對近年來華南地區豬致病性大腸桿菌的優勢血清型做了系統調查，為以后大腸桿菌疫苗研制和疫病防控奠定了基礎。

［1］ 陸承平．獸醫微生物學［M］．3版．北京：中國農業出版社，2001：215－223．

［2］ 閆祖書，魏揀選，張彥明，等．陜西省部分地區仔豬水腫病病原的分離鑒定［J］．動物醫學進展，2005，26（7）：79－81．

［3］ 張曉東．一例雞大腸桿菌的分離與鑒定［J］．中國家禽，2011，33（17）：55．

［4］ 王紅琳，熊忠良，周紹鳳，等．湖北省仔豬致病性大腸桿菌血清型鑒定［J］．動物醫學進展，2002，23（3）：68－69．

［5］ 黃炯，黃麗茜，卓菲婭，等．雞致病性埃希氏大腸桿菌不同菌株間同源性抗原的研究［J］．中國畜禽傳染病，1998，20（3）：163－164．

［6］ 陶勇．四川雞源致病性大腸桿菌血清型鑒定及質粒DNA分析［D］．雅安：四川農業大學，2001．

［7］ 高云英，李浩波，李琳，等．陜西仔豬致病性大腸桿菌的分離鑒定和耐藥性測定［J］．中國農學通報，2005，21（9）：12－15．

［8］ 陳祥，趙李祥，高崧，等．豬源大腸桿菌（ETEC、STEC、AEEC）毒力基因及其與O抗原型的關系［J］．微生物學報，2008，48（7）：857－862．

［9］ 姜衛東，黃引賢．廣東省仔豬腹瀉大腸桿菌血清型鑒定［J］．中國獸醫學報，1998，18（1）：64－66．

［10］蘇丹萍，趙彥宗，陳敏鴻，等．廣東地區部分豬場大腸桿菌的分離鑒定及藥敏試驗［J］．畜牧與獸醫，2010，42（7）：80－82．