兩種牛結核病檢測方法的比較

王 芳，張彥昌

（河北省邯鄲市動物疫病預防控制中心，河北 邯鄲056005）

牛結核病是由牛分支桿菌和結核分支桿菌引起的一種人畜共患的慢性傳染病，嚴重威脅人類生命健康和畜牧業的發展。目前一些發達國家已經消滅和控制了牛結核病。而更多國家，尤其是第三世界國家，牛結核病還在廣泛流行。

凈化牛結核病的主要手段之一是檢測后淘汰陽性牛。目前世界動物衛生組織推薦的牛結核病的檢測診斷方法仍是結核菌素（PPD）變態反應試驗。另外一種是近年來國際上畜牧業發達國家剛剛流行的血清學診斷試驗－IEN－γ干擾素方法。本文是結合臨床病例就兩種檢測方法的相關性、實用性等做比較，報告如下。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 牛結核菌素購自哈藥集團生物疫苗有限公司，批號為201001。牛結核分支桿菌γ－干擾素檢測試劑為中國動物衛生與流行病學中心診斷試劑研究室提供的進口分裝γ－干擾素檢測試劑，失效期是2011年11月9日。

1．1．2 試驗動物 某奶牛場存欄奶牛。該牛場存欄奶牛約70頭，產奶量普遍不高，奶牛漸進性消瘦。在2011年9月秋季例行結核病檢測中發現過牛結核病陽性牛。選取16頭消瘦較嚴重奶牛編號（1～16號）。

1．2 方法

1．2．1 牛分支桿菌結核菌素（PPD）變態反應和γ－干擾素平行對比試驗檢測16頭奶牛。

1．2．2 牛分支桿菌結核菌素（PPD）變態反應 按《動物結核病診斷技術（GB／T18645－2002）》中結核分支桿菌PPD皮內變態反應試驗進行。無論大小牛只，一律皮內注射0．1mL（含2 000IU）牛型結核分支桿菌PPD，72h仔細觀察局部有無熱痛、腫脹等炎性反應，并以卡尺測量皮皺厚度。皮厚差小于2．0mm以下的為陰性牛，皮厚差大于或等于4．0mm的為陽性牛，皮厚差大于或等于2．0mm、小于4．0mm為疑似牛。

1．2．3 牛結核分支桿菌γ－干擾素檢測試驗，按《牛結核分支桿菌γ－干擾素檢測操作規程》進行。第一階段：全血培養，用肝素真空采血管采集16頭奶牛血液。室溫25℃6h后，加入24孔組織培養板，每頭牛加三管1．5mL分裝的抗凝血，三管分別加入刺激抗原（PBS，禽PPD，牛PPD），37℃濕溫培養箱中孵育18h，收集上層血漿每孔400μL。第二階段：牛γ－干擾素酶免疫試驗；4h后，在酶標儀上讀取OD450nm數值。

2 試驗結果

2．1 變態反應 注射牛結核菌素后第3天發現16頭牛中1頭牛皮厚差3．90mm，接近4．0mm，判定為疑似陽性；另1頭牛皮厚差小于2．0mm，判定為陰性牛；其余14頭奶牛的注射部位炎性明顯，皮厚差大于4．0mm。初步判定為陽性牛。

變態反應試驗結束后第2天，我們對16頭奶牛進行了牛結核分支桿菌γ－干擾素檢測。

2．2 牛結核分支桿菌γ－干擾素 本次試驗牛γ－干擾素陰性對照平均OD值是0．0556，陰性對照＜0．130；陽性平均 OD值對照2．119，陽性對照＞0．700。同時各陰性對照重復孔差值不大于0．040，陽性對照重復孔OD值變化幅度不超過其平均OD值的30%。試驗成立。

所有樣本陰性抗原OD值0．0696，禽PPD抗原OD值0．189，牛PPD抗原 OD值1．02。

15頭牛γ－干擾素檢測結果和變態反應結果一致，只有2號牛出現兩種檢測方法不一樣的情況。

2．3 兩種檢測方法具體數值

2．4 2號牛γ－干擾素呈現陰性，而變態反應是弱陽性；9號牛兩種檢測方法均出現弱陽性，可以判定為疑似陽性。60d后我們對這兩頭牛再次進行變態反應試驗，其中2號牛72h皮厚差小于2．0mm，判定為陰性牛。9號牛皮厚差3．85mm，60d后再做變態反應試驗，皮厚差為4．80mm，判定為陽性牛。

3 結果分析與比較

3．1 以上結果表明，用γ－干擾素的檢測方法進行平行對比試驗，其中15頭牛的檢測結果和結核菌素變態反應結果是一致的，相關率為93．75%。

3．2 2號牛兩種檢測方法出現不同結果，應是測量皮厚差時牛的保定情況和人員主觀操作影響測量的準確度，存在誤差。

表1 檢測試驗數據

3．3 變態反應成本低，操作簡單，檢出率高。但試驗過程耗時較長，操作、解釋上存在主觀性。γ－干擾素檢出率高，耗時比變態反應縮短，易于用作牛群大量樣品的測試，沒有抗原浸入。但它的試劑價格昂貴，成本高，國內目前沒有適量規格的試劑盒出售；藥物特別是地塞米松類藥物的應用可干擾γ－干擾素的檢測，采血后8h內必須進行檢測，過程嚴格，對操作者要求高。基于以上原因，γ－干擾素檢測牛結核病的推廣目前還存在一定難度。尤其是基層疫控機構，用變態反應試驗檢測牛結核病比較實際。