恒河猴結核病的病理組織學診斷

王 衡，遠立國，喬宏勝，寧章勇，李守軍

（華南農業大學獸醫學院，廣東 廣州510642）

結核病是一種重要的慢性、消耗性人獸共患病。其病原為分支桿菌，目前可以引起人獸共患的分支桿菌主要有結核分支桿菌（Mycobacterium tuberculosis）、牛分支桿菌（Mycobacterium bovis）和禽分支桿菌（Mycobacterium avium）。

流行病學調查表明，野生動物結核病發病率具有逐年升高的趨勢。其中，牛分支桿菌感染譜較廣，如野豬［1］、羚羊、長頸鹿、美洲獅、野鹿［2－3］和狼［4］等均有感染的可能；大象可以結核分支桿菌［5］感染；鳥類對禽分支桿菌易感，同時對結核分支桿菌具有較強的抵抗力。眾多野生動物中，非人靈長類對以上3種分支桿菌均易感，其中猴子對其易感性尤為明顯［6］。研究表明，在非人靈長類動物中分支桿菌的分離率可達70%以上，其中大部分分離自猴子。國內有報道稱，在圈養結尾狐猴［7］和獼猴［8］群中曾暴發過結核病，同時獼猴和恒河猴感染結核菌后可以出現與人類相似的臨床癥狀和病理特征，因此這兩種動物常用來作為人類結核病的動物模型［9］。由于結核菌可以通過呼吸道和消化道行進傳播，野生動物感染后，不但能夠在種群中傳播，還會傳染給其他動物，研究表明，動物園內攜帶結核分支桿菌的猴子可能傳染動物園內的工作人員。因此，對結核病進行及時的診斷和防治，對于保證動物的健康和人類安全具有重要的作用。

為進一步掌握猴結核病的病理組織學特征及其病原類型，本文將采用傳統病理組織學方法和PCR技術，對1例疑似猴結核病群發病例進行診斷，結果表明，該猴群感染了牛分支桿菌，該結果將為猴結核病流行病學及病理學研究提供參考依據。

1 研究方法

1．1 切片觀察 恒河猴養殖單位送檢病死恒河猴心臟、肝臟、脾臟、腎臟等臟器，送檢病料經100mL／L中性福爾馬林溶液固定，使用LEICA RM2145型切片機進行常規石蠟切片，蘇木素－伊紅染色（hematoxylin－eosin stain，H．E．），應用ZEIZZ Axioskop2 plus光學顯微鏡觀察組織學變化。

1．2 DNA抽提 取少量組織病料，采用常規DNA抽提方法提取DNA經液氮處理研磨后，加入700 μL TE（10mol／L Tris－HCl，1mmol／L EDTA，pH值為8．0）溶液，打勻；加入200g／L SDS溶液150 μL，打勻；加入20mg／μL蛋白酶 K 20μL；打勻后50℃搖床溫育3h。溫育結束后加等量的酚／氯仿／異戊醇混合物（酚／氯仿∶異∶戊醇＝25∶24∶1），充分混勻，12 000r／min離心10min，取上清液，如此重復2～3次。向上清中加入2倍體積的無水乙醇，室溫沉淀30min，12 000r／min離心10min，棄上清。沉淀用750mL／L乙醇洗滌1次，風干后用100μL TE溶解，作為PCR模板，－20℃保存。

1．3 多重PCR檢測 參考本實驗室喬宏勝碩士建立的3種分支桿菌多重PCR檢測方法，通過比對GenBank提供的結核分支桿菌、牛分支桿菌及禽分支桿菌參考序列，分別選取差異明顯的結核分支桿菌RD10片段、牛分支桿菌moaB3片段和禽分支桿菌12－23SrDNA片段作為候選基因，用以區分三者。所用引物相關信息見表1。

以1．2制備DNA樣品為模板，使用3對引物，應用ABI 9700型PCR儀進行常規多重PCR反應，反應結束后，通過10g／L瓊脂糖凝膠電泳進行結果分析。

同時參照GenBank提供的牛分支桿菌TbD1基因設計特異性引物，上下游引物序列分別為：5′－TGGGCAGTCGTTTCGGTTGT－3′、 5′－CGGTGGCGGGCATGTAAT－3′，預期PCR 產物大小為192bp。對疑似樣品進行特異性PCR檢測，再次對多重PCR檢測結果進行確認。

2 結果

2．1 病理組織學觀察 本文主要針對送檢病死動物的肝臟、脾臟、腎臟及心臟進行了病理組織學觀察，結果如下。

肝臟：肝組織內可見體積大小不等的傳染性肉芽腫結構，體積較小的呈現為粟粒狀（見圖1B），體積較大的呈現為結節狀，結節狀肉芽腫內部可見干酪樣壞死，部分壞死灶內已經發生鈣化（見圖1A）。壞死灶外圍分布有明顯的上皮樣細胞及多核巨噬細胞，并伴有少量淋巴細胞浸潤，周圍肝細胞發生嚴重的變性壞死。粟粒性肉芽腫主要以巨噬細胞浸潤和肝細胞變性壞死為主。

表1 3種分支桿菌多重PCR檢測方法所用引物

圖1 猴肝臟、脾臟、腎臟和心臟的病理組織學觀察

有的肉芽腫以膽管為中心，表現為膽管上皮細胞壞死脫落，膽管周圍結締組織、纖維組織和巨噬細胞增生明顯，同時伴有淋巴細胞浸潤（見圖1C）。肝臟匯管區中等靜脈內膜細胞腫脹、變性、壞死脫落，并可見有特別明顯的肉芽腫結構（見圖1D）。

脾臟：脾臟內同樣可見大量的體積大小不等的傳染性肉芽腫結構，體積較大者內部發生干酪樣壞死（見圖1E）。肉芽腫周圍分布有密集的上皮樣細胞和特別明顯的多核巨噬細胞。脾臟固有結構受到擠壓，網狀內皮細胞發生脂肪變性并伴有壞死，脾臟支持組織發生纖維素樣壞死（見圖1F）。

腎臟：腎臟間質內可見有粟粒性傳染性肉芽腫，肉芽腫結構內主要分布有巨噬細胞、多核巨噬細胞和淋巴細胞，肉芽腫周圍腎小管上皮細胞壞死脫落（見圖1G）。

心臟：心臟主要表現為心外膜淤血、出血，心肌萎縮、斷裂、壞死，心肌出血（見圖1H），心內膜乳頭肌內可見有肉芽腫結構并伴有淋巴細胞浸潤（見圖1I），部分乳頭肌壞死。

2．2 PCR反應檢測分析 多重PCR檢測結果顯示，多條泳道在297bp處出現明顯的特異性條帶，而在954bp和119bp處未見明顯條帶出現，表明該病原為牛分支桿菌，而非結核分支桿菌或鳥分支桿菌（見圖2）。

圖2 多重PCR檢測結果

為進一步證明其病原類型，針對牛分支桿菌TD1基因片段設計特異性引物，進行PCR反應，最終獲得大小為190bp左右的特異性片段，與預期片段大小一致（見圖3）。以上兩種PCR檢測結果表明，引起該猴結核病的病原應為牛分支桿菌。

3 討論

本試驗檢測樣品為圈養病死恒河猴病料，該恒河猴養殖場在短時間內多只幼齡恒河猴出現呼吸困難，食欲下降，機體消瘦，精神委靡，被毛蓬亂，最終衰竭死亡。剖檢時可見全身淋巴結腫大，肺臟、肝臟、脾臟切面可見白色、灰白色結節狀病灶。對送檢樣品進行病理組織觀察發現，在肝臟、脾臟、腎臟和心臟中都可見面積大小不等的肉芽腫結構。其中腎臟和心臟中主要以較小的粟粒性肉芽腫為主；而在肝臟和脾臟中可見面積較大的結節性肉芽腫，其內部伴發干酪樣壞死，有時可見鈣化灶出現。結合臨床癥狀、剖檢變化和病理組織學觀察，初步診斷為疑似猴結核病。

圖3 牛分支桿菌特異性PCR檢測結果

由于該病例發病日齡較小，發病速度較快，并在全身多個器官內發現形態典型的傳染性肉芽腫結構，因此推斷該猴群可能為初發性結核。另外，剖檢時可見肺結核及淋巴結腫大，同時在靜脈內膜、心臟乳頭肌和腎臟中可見粟粒性結核，由此推斷，該結核可能通過管道蔓延、淋巴源性蔓延和血源性蔓延3種途徑在體內不斷擴散。

為進一步確認病理組織學診斷結果，本試驗相繼采用多重PCR和特異性PCR方法對樣品進行檢測。該多重PCR反應可用于區分結核分支桿菌、牛分支桿菌和禽分支桿菌3種分支桿菌，檢測結果表明，該結核病病原應為牛分支桿菌。同時采用針對牛分支桿菌TD1基因片段特異性引物，進行再次檢測，以確認多重PCR結果。兩種PCR結果表明，該病例為非人靈長類感染牛分支桿菌病例，進一步證明恒河猴具有感染牛分支桿菌的可能。有試驗表明，猴對3種分支桿菌均易感，而究竟哪種最易感、哪種對猴致病性最強，暫時還沒有明確的記載。本診斷結果再次證明恒河猴可以感染牛分支桿菌，對于恒河猴初次感染病例，牛分支桿菌對其具有較強的致病性，尤其是幼齡猴，可以在短時間內蔓延至全身多個器官，并最終引起死亡。

本診斷結果僅對該病例進行了病原性診斷，病死猴群如何感染牛分支桿菌，還需對猴群免疫情況、繁殖背景以及養殖環境進行進一步的分析和探究。

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