3種稀釋液對雞精液體外常溫保存的影響

陶金忠，石永宏，姜 峰，單海濤，王 冀

（1．寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川750021；2．寧夏九三零生態(tài)農(nóng)牧公司，寧夏 銀川750021）

為了長時間的保存精液且能夠擴(kuò)大精液的劑量，在精液中加入稀釋液，其目的是為了保護(hù)精子有一個適合的存活環(huán)境，它需要維持適合的滲透壓和電解質(zhì)平衡，保證精子細(xì)胞膜的完整不受到傷害，維持精清的環(huán)境，能夠給精子營養(yǎng)，提高其耐受溫性、抗凍性、精子的活力和頂體完整，降低精子畸形率［1］。因此在稀釋液中常加入一些保護(hù)劑成分。稀釋液中保護(hù)劑常用的保護(hù)劑有糖類、卵黃、抗凍劑、非電解質(zhì)、抑菌物質(zhì)和抗氧化物質(zhì)等［2］。

目前進(jìn)行精液常溫稀釋保存的相關(guān)研究較少，也沒有適合常溫保存的雞精液稀釋液的配方。為了使精子在體外保存更長的時間。故擬在精液稀釋液中添加稀釋液，并通過本試驗選擇最佳的稀釋液，以提高雞精子的保存時間和利用率。

1 材料與方法

1．1 材料、藥品和儀器 材料：選擇寧夏九三零生態(tài)農(nóng)牧公司30只健康公雞，分為3組，每組10只，采用按摩法采集新鮮精液，立即用3種稀釋液稀釋。藥品與儀器：檸檬酸，Tris，磷酸二氫鈉，磷酸氫二鈉，豬精液稀釋液，相差顯微鏡，電子稱，量筒等。

1．2 試驗方法

1．2．1 配制稀釋液 3種稀釋液配制：檸檬酸－Tris稀釋液：果糖1g，檸檬酸1．4g，Tris堿2．42 g，配置100mL；磷酸鹽稀釋液：果糖3．6g，磷酸氫二鈉0．212 2g，磷酸二氫鈉0．3g，配置100mL；豬精液稀釋液：德國豬精液稀釋粉5g，配置100mL。并且在3種稀釋液中均加入少許青霉素。

1．2．2 精液稀釋 采集的精液應(yīng)用配制好的3種稀釋液進(jìn)行2倍稀釋，混勻，注意保溫，避免震蕩、光照。置于17℃條件下，間隔不同時間觀察精子活力、精子畸形數(shù)以及頂體完整數(shù)。并記錄精子的存活時間，計算出存活指數(shù)。

1．2．3 精子形態(tài)和畸形率的測定及精子頂體染色觀察 準(zhǔn)備潔凈的載玻片進(jìn)行涂片，風(fēng)干后用中性福爾馬林固定液15min，水洗晾干用Giemsa染液扣染2h，水洗晾干。

1．2．4 活力檢測 在溫度37℃、400倍顯微鏡下觀察直線運(yùn)動的精子。精子的活力＝直線運(yùn)動的精子／總精子個數(shù)×100%。

1．2．5 畸形率測定 將準(zhǔn)備好的抹片在顯微鏡下觀察，每個抹片觀察200個精子。畸形包括頭部畸形、頸部畸形、尾部畸形。精子畸形率%＝畸形精子數(shù)／精子總數(shù)×100%。

1．2．6 頂體完整率測定 將準(zhǔn)備好的抹片在顯微鏡下觀察，每個抹片觀察200個精子。精子頂體不完整情況分為：頂體膨脹、部分脫落、完全脫落、頭部畸形。精子頂體完整率%＝頂體完整的精子數(shù)／精子總數(shù)×100%。

1．2．7 存活時間測定 將精液置于室溫（17℃）下保存，設(shè)定不同時間間隔定時滴片鏡檢。精子的存活時間（h）＝檢查間隔時間的總和減去最末兩次檢查間隔時間的一半。

1．2．8 存活指數(shù)測定 精子的存活指數(shù)＝每前后相鄰兩次檢查精子活力的平均數(shù)與間隔時間乘積的總和。

1．3 統(tǒng)計分析 用SPSS11．0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2．1 3種稀釋液對精子活力的影響 見表1。

從表1可以看出，添加磷酸鹽稀釋液的精子存活時間最長。從活力來看，在15h時，保存精液活力達(dá)50%的磷酸鹽緩沖液和檸檬酸－Tris效果相當(dāng)，但豬精液稀釋液保存精子活力最差，與其他兩個相比，差異顯著。

2．2 3種稀釋液對精子的畸形率的影響 見表2。

通過試驗和試驗數(shù)據(jù)表明，相比之下，在3種稀釋液中，添加磷酸鹽稀釋液的精子畸形率最低，添加豬精液稀釋液的精子畸形率較高，添加檸檬酸－Tris稀釋液的精子畸形率最高，但差異不顯著。

表1 3種稀釋液對精子活力（%）的影響

表2 3種稀釋液對精子的畸形率的影響

2．3 3種稀釋液對精子的頂體完整率的影響 見表3。

表3 3種稀釋液對精子的頂體完整率的影響

從表3可以看出，3種稀釋液對雞精液常溫保存頂體完整率沒有顯著性影響，但豬精液稀釋液稀釋時頂體完整率較低，為91．61%±0．50%。添加檸檬酸－Tris稀釋液的精子頂體完整率最高為94．19%±0．41%。

2．4 3種稀釋液對精子的存活時間的影響 見表4。

表4 3種稀釋液對精子的存活時間的影響

從表4的3種稀釋液對雞精液常溫保存存活時間影響來看，添加磷酸鹽稀釋液的精子存活時間最長，顯著的高于其他兩組。

2．5 3種稀釋液對精子的存活指數(shù)的影響 見表5。

表5 3種稀釋液對精子的存活指數(shù)的影響

從表5來看，在3種稀釋液中，添加磷酸鹽稀釋液的精子存活指數(shù)最大。顯著的高于其他兩組，而檸檬酸－Tris稀釋液顯著高于豬精液稀釋液組。

3 討論

3．1 檸檬酸－Tris稀釋液對雞精液體外常溫保存的影響 檸檬酸是一種重要的有機(jī)酸，它是一種三羧酸類化合物。Tris又叫三羥甲基氨基甲烷。由于Tris緩沖液為弱堿性溶液。檸檬酸－Tris稀釋液也能適當(dāng)?shù)奶岣呔拥幕盍σ约氨４鏁r間。檸檬酸－Tris稀釋液一般用于牛精液的冷凍保存，從未運(yùn)用到雞精液的常溫保存。本次試驗嘗試將檸檬酸－Tris稀釋液運(yùn)用到雞精液的常溫保存中去，效果不是很明顯［7］。

3．2 磷酸鹽稀釋液對雞精液體外常溫保存的影響

磷酸鹽緩沖液（簡稱PBS）是常用的用于生物學(xué)研究的一個緩沖溶液。緩沖液有助于保持恒定的pH值。解決方案的滲透壓和離子濃度。通常與畜體pH值相近等滲［8］。試驗中運(yùn)用磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉作為緩沖液，雞的精液用這種稀釋液后，能提高精子的活力、存活時間，也能降低精子的畸形率，對于雞精液的常溫保存有非常顯著的影響。

3．3 豬精液稀釋液對雞精液體外常溫保存的影響

豬精液稀釋液一般用于豬的精液的常溫保存。本試驗所用的豬精液的稀釋液多為碳酸氫鈉、氨苯磺胺、檸檬酸鈉以及安鈉咖按照一定比例配置而成［9］。豬精液稀釋液以前從來沒有用到雞精液的常溫保存中，對于雞精液的常溫保存，效果不是很明顯［10］。

3．4 3種精液稀釋液對雞精液常溫保存的影響這3種稀釋液中，在檸檬酸－Tris稀釋液中精子活力較強(qiáng)，豬精液稀釋液中精子活力最弱，在磷酸鹽稀釋液中精子活力最強(qiáng)。并且在磷酸鹽稀釋液中精子的存活時間和存活指數(shù)都強(qiáng)于其他兩種稀釋液。在檸檬酸－Tris稀釋液中精子的畸形率最高，豬精液稀釋液中精子畸形率較低，而在磷酸鹽稀釋液中精子的畸形率最低。在檸檬酸－Tris稀釋液中精子的頂體完整率最高，在磷酸鹽稀釋液中精子的頂體完整率較高，在豬精液稀釋液中精子的頂體完整率最低。

4 結(jié)論

通過試驗結(jié)果表明，3種稀釋液中，添加磷酸鹽稀釋液的精子活力最強(qiáng)、精子存活時間最長、精子存活指數(shù)最大、精子的畸形率最小，并且精子的頂體完整率也很高，與添加檸檬酸－Tris稀釋液的精液差異不顯著。因此，磷酸鹽稀釋液最適合雞精液的體外常溫保存。

［1］ 楊燦峰，楊利國．幾種常用營養(yǎng)試劑對山羊精子活率的影響［J］．江西畜牧獸醫(yī)雜志，2002，4：56－62．

［2］ 韓雪峰，劉福柱，楊長鎖．公雞精液稀釋液的研究進(jìn)展［J］．甘肅畜牧獸醫(yī)，2003，6：40－43．

［3］ 權(quán)凱，黃炎坤．雞精液稀釋液研究進(jìn)展［J］．養(yǎng)禽與禽病防治，2006，2：4－6．

［4］ 張進(jìn)幫．雞精液稀釋液篩選試驗［J］．甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1992，27（4）：333－338．

［5］ 李世英，李煥玲，胡松庭，等．雞精液冷凍技術(shù)研究［J］．中國家禽，1995，4：25－26．

［6］ 張兆旺．稀釋液溶質(zhì)和滲透壓對雞精子體外存活及形態(tài)的影響［J］．中國家禽，2001，238：50－52．

［7］ 朱慶．不同稀釋液和稀釋倍數(shù)對雞人工授精受精率的影響［J］．四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1994，14（1）：25－28．

［8］ 王元興，郎介金．動物繁殖學(xué)［M］．南京：江蘇科學(xué)技術(shù)出版社，1997：87－90．

［9］ 張一玲．家畜繁殖學(xué)實驗實習(xí)指導(dǎo)［M］．北京：農(nóng)業(yè)出版社，1991：33－36．

［10］牛巖，郭良星．家禽人工授精技術(shù)［M］．鄭州：河南科學(xué)技術(shù)出版社，2003：45－49．