雞傳染性支氣管炎病毒變異株ZZ2004 RT－PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用

姚四新，王憲文，趙淑秋，劉興友

（1．河南科技學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng)453003；

2．動(dòng)物疫病和殘留物防控河南省高校工程技術(shù)研究中心，河南 新鄉(xiāng)453003）

雞傳染性支氣管炎病毒（IBV）屬于冠狀病毒科（Coronavirdae）冠狀病毒屬（Coronavirus）的病毒。該病毒的特點(diǎn)是S1基因極易變異，導(dǎo)致新的血清型不斷出現(xiàn)。臨床上常見的有呼吸型、腎型、腸炎型及腺胃型傳染性支氣管炎［1－4］。2004年3月我們從河南鄭州地區(qū)具有腹瀉、呼吸道癥狀及腎臟病變的肉雞及無明顯癥狀僅生長(zhǎng)緩慢的肉鴨體內(nèi)分離到1株能引起雞胚蜷縮、出血的傳染性支氣管炎病毒，該毒株和其他血清型IBV毒株之間沒有交叉的血清學(xué)關(guān)系，證實(shí)為一種新的變異株，命名為ZZ2004。感染后雞群主要特征是：病雞氣管啰音、咳嗽和打噴嚏，主要侵害雞的呼吸、泌尿生殖、免疫系統(tǒng)和消化系統(tǒng)等。該病發(fā)病率很高，可導(dǎo)致感染的肉雞群免疫功能及增重和飼料報(bào)酬顯著降低，可致幼雞死亡，同時(shí)還可影響肉鴨的生長(zhǎng)發(fā)育，嚴(yán)重者導(dǎo)致死亡。但只憑這些臨床癥狀及剖檢病變往往不能準(zhǔn)確判斷病因．必須依靠實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)［5－6］。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，國(guó)內(nèi)許多學(xué)者已經(jīng)將RT－PCR技術(shù)應(yīng)用于IBV的檢測(cè)［7－9］。

IBV為不分節(jié)段的單股正鏈RNA病毒，其中mRNA3含有3個(gè)ORF，分別為3a，3b和3c，分別編碼3種小蛋白即3a、3b、E（envelop E），其大小分別為6．7kD、7．4kD和12．4kD，其中3cORF的啟動(dòng)子效率最高 ，12．4kD產(chǎn)物的表達(dá)量最大 ，其疏水氨基酸的組成特點(diǎn)揭示了該蛋白與病毒囊膜的嵌合 ，這可能與病毒的復(fù)制有關(guān)。筆者將ZZ2004 3a、3b及E基因作為RT－PCR診斷的基因，根據(jù)其保守序列，設(shè)計(jì)并合成了一對(duì)引物，建立了檢測(cè)IBV ZZ2004變異株的RT－PCR方法。

1 材料與方法

1．1 菌株、載體及試劑 RNA提取試劑盒、Ecoli JM109、pMD18－T、RT－PC試劑盒、凝膠 DNA快速純化回收試劑盒，購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；Trizol，購(gòu)自Invitrogen公司。

1．2 病毒 雞傳染性支氣管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）ZZ2004由本實(shí)驗(yàn)室分離并保存。IBV M41、H120、H52毒株以及新城疫病毒（NDV）、禽流感病毒（AIV）、傳染性囊病病毒（IBDV），由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。

1．3 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中雞傳染性支氣管炎病毒ZZ2004株的3a、3b和3c部分序列，用Oligo 6軟件設(shè)計(jì)了1對(duì)引物，具體引物序列如下：

上游引物：5′－TTAGAGAGTGCGTTGTAGCA－3′，下游引物：5′－AGCTCCTGGAACTACTACCC－3′，兩引物之間的跨幅為540bp，由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。

1．4 病毒RNA的提取 用DNA／RNA提取試劑盒（MiniBEST Viral RNA／DNA Extraction Kit Ver．3．0）提取RNA，參照試劑盒說明書進(jìn)行。

1．5 cDNA合成及PCR擴(kuò)增 反轉(zhuǎn)錄程序?yàn)?0℃10min，42℃30min，95℃5min，4℃保存。

PCR反應(yīng)程序：94℃，5min；94℃1min，55℃2 min，72℃2min，共35個(gè)循環(huán)，最后于72℃延伸10 min。反應(yīng)產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定

1．6 特異性測(cè)定 應(yīng)用所建立的PCR方法擴(kuò)增IBV ZZ2004以及 NDV、IBV（G 毒株）、IBV（HN 毒株）、IBDV檢測(cè)該方法的特異性。回收IBV RT－PCR電泳條帶，與pMD18－T載體相連，轉(zhuǎn)化感受態(tài)Ecoli JM109，鋪氨芐抗性LB瓊脂平板（Amp＋）37℃倒置培養(yǎng)，經(jīng)鑒定后挑取陽性菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，送TaKaRa公司測(cè)序。

1．7 敏感性測(cè)定 將按1．4方法制備的IBV cDNA，然后進(jìn)行10倍比稀釋，取5μL做模板，其他條件不變進(jìn)行PCR檢測(cè)擴(kuò)增。以出現(xiàn)陽性反應(yīng)條帶模板用量的最高稀釋倍數(shù)，計(jì)算可檢出最低IBV－cDNA量。

1．8 疑似分離毒株的檢測(cè) 應(yīng)用建立的RT－PCR方法對(duì)從河南省分離的10株疑似雞IBV ZZ2004進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2．1 IBV M基因的RT－PCR特異性檢測(cè)結(jié)果

2．1．1 IBV－cDNA 含量測(cè)定 從IBV ZZ2004雞胚尿囊液中反轉(zhuǎn)錄出的IBV－cDNA，經(jīng)Eppendorf Biophotometer蛋白核酸測(cè)定儀測(cè)定IBV－cDNA終濃度為30．5μg／mL。

2．1．2 IBV 3a、3b基因和3c基因的RT－PCR檢測(cè)結(jié)果 采用1．3設(shè)計(jì)的引物從IBV ZZ2004雞胚尿囊液中擴(kuò)增出長(zhǎng)度為540bp的片段（圖1）

圖1 ZZ2004病毒基因的RT－PCR鑒定

2．1．3 RT－PCR檢測(cè) IBV的特異性結(jié)果 應(yīng)用所建立的RT－PCR方法擴(kuò)增IBV ZZ2004以及NDV、IBV（G 毒 株）、IBV（HN 毒 株）、IBDV，僅 IBV ZZ2004出現(xiàn)特異性目的條帶，其他均未擴(kuò)出任何條帶，證明該方法具有良好的特異性（圖2）。

圖2 ZZ2004病毒基因的特異性RT－PCR試驗(yàn)結(jié)果

2．2 RT－PCR檢測(cè)IBVZZ2004的敏感性 將已知含量的IBV－cDNA，進(jìn)行10倍比稀釋分別進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示，本方法可檢出1．525ng的IBV－cDNA（圖3）。

圖3 ZZ2004病毒基因的敏感性PCR試驗(yàn)結(jié)果

2．3 疑似分離毒株的檢測(cè)方法 應(yīng)用建立的RTPCR方法對(duì)從河南省分離的10株疑似雞IBV ZZ2004進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果9株為陽性，結(jié)果見圖4。

3 討論

本試驗(yàn)建立的RT－PCR技術(shù)對(duì)IBV ZZ2004檢測(cè)有極強(qiáng)的特異性，應(yīng)用RT－PCR方法檢測(cè)雞IBV國(guó)內(nèi)外均有報(bào)道［9－11］，但大都以 M 基因和N基因?yàn)槟康幕颍谏陿I(yè)等（2007）［12］選取變異頻率很大的免疫原S1基因，所建立的RT－PCR檢測(cè)方法可以特異性的檢測(cè)鑒定出具體的血清型或基因型。此外，IBV基因組較大，在提取、反轉(zhuǎn)錄等過程中很容易斷裂，用跨度大的引物進(jìn)行擴(kuò)增難度較大。針對(duì)上述特點(diǎn)，本試驗(yàn)通過比較已發(fā)表的各血清型的3a、3b基因及E基因序列，選取跨越IBV 540bp片段的引物，既降低了擴(kuò)增的難度，使得試驗(yàn)容易操作，又保證了反應(yīng)的特異性。用同樣的PCR 擴(kuò)增技術(shù)對(duì) M41、H120、H52、NDV、IBDV、AIV進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果均為陰性，其他血清型的標(biāo)準(zhǔn)毒株也未出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，只有IBV ZZ2004呈陽性，表明本試驗(yàn)所建立的方法特異性強(qiáng)，可以準(zhǔn)確地將IBV ZZ2004與其他IBV血清型區(qū)別開來，這對(duì)鑒別診斷IBV ZZ2004變異株有重要意義。敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法可檢出最低限量為1．525pg的模板，而且經(jīng)多次試驗(yàn)結(jié)果相同，證明建立的檢測(cè)方法具有較高的敏感性。雖然本試驗(yàn)所建立的RT－PCR檢測(cè)法具有快速、敏感、特異等特點(diǎn)，但此方法能否區(qū)分IBV疫苗毒和感染毒尚有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。

總之，迄今為止國(guó)內(nèi)外有關(guān)應(yīng)用RT－PCR技術(shù)檢測(cè)IBV的方法很多，但以3a、3b基因及E基因序列為目的基因者鮮有報(bào)道，本試驗(yàn)針對(duì)感染雞同時(shí)又感染鴨的IBV ZZ2004進(jìn)行特異性診斷與檢測(cè)，有望為IBV致病機(jī)制的深入研究打下基礎(chǔ)。

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