病毒上清液促進體外培養INS－1細胞系胰島素分泌

那日蘇，馬 聰，程園園，鄭旭磊，劉巧蕊

(上海市徐匯區中心醫院內分泌科，上海200031)

信號傳導與轉錄激活因子(signal transducer and activitor of transcrrption，STATs)是一類通過酪氨酸磷酸化激活的轉錄因子家族。STAT5是這一家族的重要成員，有STAT5A和STAT5B兩種異構體，兩者具有高度同源性，它們可以在接受生長激素、催乳素、干擾素以及促紅細胞生成素等多種激素或細胞因子刺激后，通過酪氨酸磷酸化偶聯形成二聚體，獲得進入細胞核的能力，影響目的基因的轉錄，從而廣泛參與細胞的增殖和分化，調節細胞的凋亡。由生長激素及催乳素介導的STAT5信號通路是胰腺β細胞中主要的信號傳導通路［1］。本研究擬利用反轉錄病毒介導的持續激活的STAT5A基因感染胰腺INS-1細胞來觀察STAT5的活性對INS-1細胞增殖及其分泌胰島素功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料:INS-1細胞及293T細胞(上海細胞庫);胰島素放免試劑盒(中國原子能研究所);FuGENE6試劑盒(Roche公司);胎牛血清(杭州四季青公司);RPMI1640培養液和瓊脂糖(GibcoBRL公司);蛋白酶K、RNase及四氮唑藍(methylthiazolyltetrazolium，MTT)(Sigma公司);磷酸化 stat5a抗體及actin抗體(Santa Cruz公司)。

1.2 病毒上清液制備:反轉錄病毒載體介導的MSCV-EGFPSTAT5ADeltaN(R20)，即小鼠stat5a cDNA的1-136位氨基酸被剪切后獲得的具有持續激活功能的STAT5A，以及反轉錄病毒載體MSCV-EGFP(EGFP)(Dr．Moriggl所贈)。將相同劑量的包裝質粒DNA及R20或EGFP質粒DNA混合后，按照FuGENE6試劑盒內的操作手冊轉染293T細胞，添加含10%胎牛血清的DMEM培養液3 mL，72 h后收獲病毒上清。

1.3 病毒感染INS-1細胞:接種相同數目的INS-1細胞，分為EGFP對照組及R20即STAT5活性增強組。用先前制備好的病毒上清對應各組進行感染。

1.4 Western blot:兩組細胞被感染72 h后提取蛋白，BAC法測定蛋白濃度，常規Western blot操作。……