DJ－1拮抗ROS介導(dǎo)Beclin－1上調(diào)在缺氧復(fù)氧HL－1心肌細(xì)胞中的作用

晏 浩，李文林，徐建軍，朱書強(qiáng)，龍 翔，車建鵬

(南昌大學(xué)1.第二附屬醫(yī)院胸心外科;2.醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，江西南昌330006)

癌基因DJ-1(CAP1/RS/PARK7)在腫瘤生物學(xué)中發(fā)揮極為重要的作用，它可保護(hù)腫瘤細(xì)胞應(yīng)對(duì)缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡和適應(yīng)氧化應(yīng)激［1］。DJ-1在人體各正常組織又廣泛表達(dá)，其通過在亞細(xì)胞水平的再分布發(fā)揮多重作用。常染色體隱性遺傳DJ-1突變可以導(dǎo)致早發(fā)型帕金森病，缺乏DJ-1類型的帕金森病患者對(duì)中風(fēng)損傷更易感，而恢復(fù)DJ-1表達(dá)可以明顯減少氧化應(yīng)激［2］。心肌缺血再灌注后往往同時(shí)出現(xiàn)壞死、凋亡和自噬［3］;其中，自噬是細(xì)胞長(zhǎng)存蛋白和細(xì)胞器代謝的主要方式。缺血再灌注損傷不同階段自噬發(fā)揮不同作用，缺血階段AMPKa啟動(dòng)低程度自噬被認(rèn)為是應(yīng)急供能的保護(hù)作用，而再灌注階段通過激活JNK導(dǎo)致過表達(dá)Beclin-1，過度自噬加重心肌損傷［4］。最近研究認(rèn)為DJ-1參與自噬調(diào)控［5］，本研究通過以慢病毒為載體干擾心肌HL-1細(xì)胞DJ-1基因表達(dá)，探討其對(duì)缺氧復(fù)氧損傷中ROS影響對(duì)心肌自噬及預(yù)后的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

annexinⅤ-PI凋亡檢測(cè)試劑盒和活性氧檢測(cè)試劑盒 (南京凱基公司);monodansylcadaverin(MDC)和N-acetylcysteine(NAC)(Sigma-Aldrich美國(guó));DJ-1shRNA慢病毒(sc-37081)、空對(duì)照慢病毒(sc-108080)和抗體 β-actin(Santa Cruz公司);抗體 Beclin-1(Cell Signaling公司)和 DJ-1、LC3(Abcam公司)及辣根過氧化物酶偶聯(lián)抗體(北京中杉公司);增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光顯色試劑盒(Thermo公司);蛋白提取試劑盒、蛋白酶磷酸酶復(fù)合抑制劑(普利萊公司);BCA蛋白定量(碧云天公司);其他試劑均為市售分析純。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞系培養(yǎng)和sh-DJ-1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞篩選:小鼠心肌HL-1細(xì)胞系……