細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合溫敏性水凝膠與膀胱上皮細(xì)胞的生物相容性

楊淑紅 楊嗣星 姚 頤 廖文彪 趙凱亮 李永偉 宋 超武漢大學(xué)人民醫(yī)院泌尿外科，湖北武漢 430060

支架材料是組織工程學(xué)研究的重要內(nèi)容之一。理想的組織工程支架材料必須具有良好的生物相容性，而且適合種子細(xì)胞在支架上黏附、生長[1]。溫度敏感性水凝膠（temperature sensitivity hydrogel，TSH）又被稱為溫固化水凝膠，當(dāng)溫度超過相變溫度時(shí)，黏度急劇增高，由液態(tài)變?yōu)槟z態(tài)[2]。本研究小組在前期已證實(shí)經(jīng)TSH改良的細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）所制備的復(fù)合支架材料與膀胱平滑肌細(xì)胞具有良好的相容性[3]。為給體內(nèi)研究提供更充足的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，本研究將進(jìn)一步探索該支架材料與膀胱移行上皮的生物相容性。

1 材料與方法

1.1 主要材料與設(shè)備

新西蘭兔由武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；主要試劑有：PEO-PPO-PEO三嵌段共聚物（購于BASF公司），小鼠抗兔細(xì)胞角蛋白單克隆抗體 （AE1/AE3）（購于Santa Cruz公司），F(xiàn)ITC標(biāo)記羊抗小鼠單抗隆抗體 （購于Abcam公司），磷酸緩沖鹽溶液 （phosphate buffered saline，PBS），甲醇、丙酮、戊二醛，DMEM F12培養(yǎng)基，Dispase酶，Ⅱ型膠原酶，胎牛血清（fatal bovine serum，F(xiàn)BS），二甲基亞砜（DMSO）、MTT均購于Sigma公司。相差倒置顯微鏡 （日本OLYMPUS），恒溫培養(yǎng)箱（日本Napco公司），超凈操作工作臺(tái)（北京半導(dǎo)體設(shè)備一廠），掃描電子顯微鏡（日本SANYO）。

1.2 方法

1.2.1 兔膀胱移行上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定 選用4周齡新西蘭兔，雌雄不限，體重2.0～2.5 kg，空氣栓塞處死后，無菌條件下取膀胱前壁組織（2 cm×2 cm），小心分離膀胱黏膜與肌層，將黏膜層組織迅速置入含慶大霉素（20 μg/mL）的PBS中浸泡并漂洗3次。將黏膜組織剪碎成1 mm2大小的組織塊，轉(zhuǎn)入新鮮配制的Dispase酶消化液中，于4℃下消化18 h后再用PBS洗滌1次，用不銹鋼網(wǎng)濾去組織殘塊，收集細(xì)胞懸液于混合消化液 （0.02%EDTA+0.25%胰酶）中。37℃振蕩消化10 min，每2分鐘吹打1次，直至成為單細(xì)胞懸液，加入FBS終止消化，PBS洗滌3遍，離心8 min（1000 r/min），棄上清，用培養(yǎng)液吹打混勻，再將細(xì)胞接種到含10%FBS的DMEM-F12培養(yǎng)基中，置37℃恒溫、5%CO2飽和濕度孵箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。

將上述培養(yǎng)的細(xì)胞傳2～4代后接種于蓋玻片上再培養(yǎng)2 d，待細(xì)胞完全貼壁后，以PBS液沖洗，甲醇、丙酮固定10 min，以小鼠抗兔細(xì)胞角蛋白單克隆抗體（AE1/AE3）為一抗，以FITC標(biāo)記羊抗小鼠單抗隆抗體為二抗，孵育、中性樹膠封片，于490 nm的藍(lán)色熒光倒置顯微鏡下觀察。以PBS代替一抗作為空白對照。

1.2.2 ECM/TSH復(fù)合支架的構(gòu)建 參考本小組前期研究[3]的方法制備TSH，使用前紫外線照射30 min備用。參照Yang等[4]報(bào)道的方法制備ECM，將成品分成32塊（1 cm×1 cm），經(jīng)冷凍干燥后，環(huán)氧乙烷消毒，干燥保存于4℃。在低溫（4℃）真空環(huán)境下，將16塊制備的ECM浸入TSH溶液中1 h，取出后經(jīng)低溫冷凍干燥機(jī)凍干，分裝密封，經(jīng)環(huán)氧乙烷消毒，常溫干燥保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 細(xì)胞相容性 實(shí)驗(yàn)分為四組，每組16孔，A組：ECM/TSH復(fù)合支架種植膀胱上皮細(xì)胞組；B組：單純ECM種植膀胱上皮細(xì)胞組；C組：單純培養(yǎng)膀胱上皮細(xì)胞組；D組：無細(xì)胞培養(yǎng)液組。種植細(xì)胞前先用培養(yǎng)液將支架材料預(yù)濕，取第3代膀胱上皮細(xì)胞懸液 （濃度1×105/mL）50 L緩慢接種于材料上，4 h后再加入DMEM F12培養(yǎng)基（含F(xiàn)BS），置37℃恒溫、5%CO2飽和濕度孵箱內(nèi)培養(yǎng)，2 d后換液，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞黏附、生長情況。

1.2.4 膀胱上皮細(xì)胞生長情況掃描電鏡觀察 膀胱上皮細(xì)胞與支架材料復(fù)合培養(yǎng)48 h后，A、B組各取一塊材料/細(xì)胞復(fù)合物，經(jīng)過PBS漂洗3次，3%戊二醛、2%的四氧化鋨雙重固定、脫水、醋酸異戊酯置換、干燥、噴金，掃描電鏡觀察。

1.2.5 細(xì)胞活力檢測 膀胱上皮細(xì)胞接種后，分別于1、3、5和7 d每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各取4孔，分別加入MTT（5 mg/mL），酶反應(yīng) 4 h，棄上清，加入 150 μL DMSO，震蕩 10 min，在酶聯(lián)免疫檢測儀上選擇490 nm波長讀取吸光度（OD）值（A），計(jì)算細(xì)胞相對增值率（relative growth rate，RGR）：RGR=[實(shí)驗(yàn)組（A組）A值-空白組（D組）A值]/[陰性對照組（C組）A值-空白組（D 組）A 值]×100%。

1.2.6 細(xì)胞計(jì)數(shù) 每5、10天從A、B兩組中各取一塊支架材料，用PBS清洗，去除未附著的細(xì)胞，再用0.25%胰酶消化，血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，觀察細(xì)胞黏附數(shù)量及增殖情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 13.0對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 原代培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)

圖1 空白對照組熒光顯微鏡觀察（×200）

細(xì)胞接種時(shí)呈圓形，大小均一，輪廓清晰，胞漿透亮。接種24 h后，可見細(xì)胞貼壁生長，細(xì)胞密集生長區(qū)域可見細(xì)胞伸展后相互連接呈簇狀，呈散在的簇片狀分布，細(xì)胞間連接緊密，形態(tài)呈典型的“鋪路石樣”表現(xiàn)，符合上皮細(xì)胞特征。3 d后細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期，7 d可連接成片，長滿整個(gè)培養(yǎng)瓶底部。

免疫熒光檢測，各代培養(yǎng)細(xì)胞角蛋白免疫熒光均為陽性，在藍(lán)色熒光的照射下激發(fā)出綠色熒光，陽性率約99%。而空白對照組未激發(fā)出綠色熒光（圖1），培養(yǎng)（12 h）的膀胱黏膜上皮細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，細(xì)胞排列呈典型的“鋪路石樣”表現(xiàn)。

2.2 組織學(xué)檢查

2.2.1 種植細(xì)胞前后的復(fù)合支架材料 倒置相差顯微鏡下觀察：ECM為網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，HE染色后可見紅染的膠原纖維規(guī)則排布，纖維較細(xì)，網(wǎng)孔較大，未見到細(xì)胞碎片；復(fù)合TSH后膠原直徑變粗，網(wǎng)孔孔徑變小。種植膀胱上皮細(xì)胞后4 h，光鏡下可見細(xì)胞緊密黏附于材料表面，少數(shù)散落到培養(yǎng)瓶底貼壁生長。加入培養(yǎng)基10 h，可見細(xì)胞已伸展，有多個(gè)突起。培養(yǎng)3 d時(shí)，黏附于材料的細(xì)胞數(shù)量增加，細(xì)胞增殖明顯。

2.2.2 掃描電鏡觀察 種植細(xì)胞前復(fù)合支架材料于掃描電鏡下觀察可見基質(zhì)材料由許多連接成網(wǎng)狀的纖維組成，纖維間呈現(xiàn)1～8 μm的微孔，凝膠分子覆蓋其上，沒有發(fā)現(xiàn)細(xì)胞碎片。種植后可見發(fā)育良好的細(xì)胞和細(xì)胞群黏附于材料上，偽足沿纖維伸展，附著較牢固，細(xì)胞間連接緊密，有的可見到ECM的分泌（圖2），可見ECM復(fù)合TSH后，膠原直徑變粗，交織成網(wǎng)。發(fā)育良好的細(xì)胞黏附于材料上，開始沿纖維伸展偽足，表面可見到ECM的分泌。

2.2.3 細(xì)胞活力測定膀胱上皮細(xì)胞在單純ECM上黏附性良好，黏附率為 83.5%（24 h ODB組/ODC組），復(fù)合了TSH 后的ECM表面黏附能力較之增強(qiáng)，黏附率為92.3%（24 h ODA組/ODC組）。從表1中數(shù)據(jù)可以得出A、C兩組的細(xì)胞數(shù)量高于B組（P=0.004），而且，A、C兩組間細(xì)胞黏附數(shù)量的差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.027），三組的細(xì)胞倍增時(shí)間均為3 d。7 d時(shí)，A組細(xì)胞數(shù)量明顯高于B、C組，組間差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.006），B、C 組間 P=0.041。

表1 不同時(shí)間各組OD值的比較（±s，n=4）

表1 不同時(shí)間各組OD值的比較（±s，n=4）

ABC 0.408±0.019 0.368±0.022 0.443±0.029 0.447±0.022 0.384±0.033 0.491±0.022 0.514±0.020 0.428±0.024 0.588±0.029 0.701±0.039 0.574±0.032 0.711±0.025組別 d1 d3 d5 d7

3 討論

組織工程學(xué)是綜合應(yīng)用工程學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的原理，將體外培養(yǎng)擴(kuò)增后的種子細(xì)胞與可降解的生物支架材料相復(fù)合，再將其回植體內(nèi)缺損部位，從而再生成具有正常結(jié)構(gòu)和功能的組織，達(dá)到真正意義上的生物學(xué)修復(fù)[5-6]。材料的生物相容性檢測是該領(lǐng)域不可缺少的重要組成部分，理想的組織工程支架材料應(yīng)當(dāng)具有良好的細(xì)胞相容性、能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖和組織形態(tài)的形成，為此本小組做了系列研究[7-8]。

與筆者前期研究結(jié)果相似，本實(shí)驗(yàn)中ECM/TSH復(fù)合材料比單純ECM，纖維直徑變粗，網(wǎng)孔孔徑變小，與接種細(xì)胞的接觸面積增大。經(jīng)TSH修飾以后的ECM對細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的黏附性，為細(xì)胞的附著、生長、增殖提供了良好的微環(huán)境。超微結(jié)構(gòu)觀察顯示，植入的膀胱上皮細(xì)胞能夠緊密地附著于ECM膠原纖維之上，細(xì)胞之間形成緊密聯(lián)結(jié)，周圍可觀察到ECM的分泌。MTT檢測結(jié)果表明膀胱上皮細(xì)胞易于在ECM/TSH復(fù)合支架材料上生長，增殖情況較好，符合膀胱黏膜上皮細(xì)胞的生長規(guī)律，細(xì)胞未見凋亡和分化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示ECM/TSH復(fù)合支架材料與膀胱黏膜上皮細(xì)胞具有良好的生物相容性，為下一步應(yīng)用于體內(nèi)研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1]Feng C，Xu YM，F(xiàn)u Q，et al.Evaluation of the biocompatibility and mechanical properties of naturally derived and synthetic scaffolds for urethral reconstruction[J].J Biomed Mater Res A，2010，94（1）： 317-325.

[2]Chiappetta DA， Sosnik A.Poly （ethylene oxide）-poly （propylene oxide） block copolymer micelles as drug delivery agents： improved hydrosolubility，stability and bioavailability ofdrugs[J].Eur J Pharm Biopharm，2007，66（3）： 303-317.

[3]Yao Y，Yang SX，Zhang C，et al.Biocompatibility of compounds of extracellular matrix and thermally reversible hydrogel[J].Journal of Wuhan University of Technology Material Science Edition，2007，22（3）：439-442.

[4]Yang SX，Yao Y，Hu YF，et al.Reconstruction of rabbit urethra using urethral extracellular matrix[J].Chin Med J （Engl），2004，117（12）：1786-1790.

[5]Engelhardt EM，Micol LA，Houis S，et al.A collagen-poly（lactic acid-co-varepsilon-caprolactone）hybrid scaffold for bladder tissue regeneration[J].Biomaterials，2011，32（16）：3969-3976.

[6]Falke G，Caffaratti J， Atala A.Tissue engineering of the bladder[J].World J Urol，2000，18（1）：36-43.

[7]Yang SX， Shen FJ， Hu YF， et al.Experimental bladder defect in rabbit repaired with homologous bladderextracellular matrix graft[J].Chin Med J （Engl），2005，118（11）：957-960.

[8]楊嗣星，申復(fù)進(jìn)，姚頤，等.血管細(xì)胞外基質(zhì)和尿道細(xì)胞外基質(zhì)修復(fù)兔尿道缺損的比較研究[J].中華泌尿外科雜志，2004，25（12）：854-856.