比色法測定四味消扶散中總三萜酸含量

章紅燕，周俐斐，林能明，蘆柏震

(浙江省腫瘤醫院，浙江 杭州 310022)

四味消扶散是根據我院臨床經驗方研制的抗腫瘤新藥，由白花蛇舌草、炒山楂等4味中藥組方，多年的臨床觀察表明，其對腫瘤患者手術、放射治療、化學治療期間的輔助治療和治療間歇、恢復期的固本治療方面，療效確切[1]。四味消扶散中含有的熊果酸、齊墩果酸等三萜酸具有抑制腫瘤細胞增殖、誘導細胞分化和凋亡等作用[2－3]。筆者采用分光光度法測定了四味消扶散中總三萜酸的含量，方法快速簡便，穩定可靠。

1 儀器與試藥

Agilent 8453型紫外分光光度儀;QC－250型超聲波清洗器(上海超聲波儀器廠)。四味消扶散(本院制劑室自制，批號分別為20061201，20070301，20070605);熊果酸對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號為110742－200415);冰乙酸，香草醛，高氯酸均為分析純。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

取四味消扶散1包(28 g)，加入95%乙醇溶液500 mL，水浴加熱回流提取2 h，放冷，濾紙減壓過濾，濾液置500 mL量瓶中，加95%乙醇定容至刻度，搖勻;從中取出0.5 mL至10 mL容量瓶中，加95%乙醇定容至刻度，搖勻，即得供試品溶液。精密稱取熊果酸對照品適量，用無水乙醇制成每1 mL含100 μg熊果酸的對照品溶液。

2.2 香草醛—高氯酸顯色條件

取供試品或對照品溶液，水浴蒸干后，加5%香草醛－冰醋酸0.4 mL，然后再加高氯酸1.0 mL溶解搖勻后，于60℃中加熱10 min，冰浴冷卻，加冰醋酸5.0 mL，搖勻即可。

2.3 波長選擇

取供試品溶液和對照品溶液，按2.2項下條件顯色反應后，于400～700 nm波長間進行掃描。結果供試品溶液與對照品溶液在544 nm處均有最大吸收峰，且空白對照無吸收，故選擇544 nm作為測定波長。

2.4 方法學考察

精密度試驗:取對照品溶液1 mL，按2.2項下條件顯色反應后，于544 nm波長處測定吸光度6次，結果分別為0.616 68，0.618 29，0.617 13，0.616 17，0.615 34，0.614 77，RSD=0.21%(n=6)。

標準曲線繪制:分別取對照品溶液 0.25，0.50，0.75，1.00，1.25，1.50 mL，按 2.2 項下條件顯色反應后，于 544 nm 波長處測定。以熊果酸對照品量(μg)為橫坐標、吸光度為縱坐標，得回歸方程 Y=0.005 2 X+0.121 8，r=0.993 6(n=6)。結果表明，熊果酸進樣量在25～125 μg范圍內與吸光度呈良好線性關系。

重現性試驗:取四味消扶散(批號為200703011)3包，按2.1項下方法制備，取出0.5 mL按2.2項下條件顯色反應，然后于544 nm 波長處測定吸光度，結果分別為 0.377 68，0.382 89，0.363 01，RSD=2.75% 。

穩定性試驗:取重現性試驗項下3份供試品溶液，分別于顯色后 0，5，10，15，20，30 min 測定吸光度。結果顯示，20 min 內RSD=0.37%，供試品溶液穩定。

加樣回收試驗:取已知含量的樣品，分別添加熊果酸對照品，按上述測定條件測定，計算回收率。結果見表1。

表1 熊果酸加樣回收試驗結果(n=6)

2.5 樣品含量測定

取3個不同批號的樣品各3包，按2.1項下方法制備，取出0.5 mL按2.2項條件顯色反應，然后于544 nm波長處測定 A，計算含量。結果見表2。

表2 樣品中總三萜酸含量測定結果

3 討論

香草醛－高氯酸比色法是測定中藥材及制劑中總三萜酸含量較常用的方法，但影響因素較多。對試劑的用量、反應時間等因素考察后，最終確定了文中的反應條件。另外，冰醋酸、香草醛、高氯酸等試劑的含水量會使最大吸收波長發生位移，并對測定靈敏度產生影響。

總三萜酸在乙醇、甲醇等極性有機溶劑中有較好的溶解度。試驗中比較了加熱回流提取1，2，3 h和超聲提取0.5 h的提取率，結果顯示四味消扶散加熱回流提取2 h與3 h總三萜酸的得率基本一致，并顯著高于超聲提取0.5 h，說明加熱回流提取2 h即可提取完全。

樣品含量測定結果表明，總三萜酸在四味消扶散中的含量可達3%以上，可能是其抗腫瘤主要成分之一。

[1]Lu BZH，Ling NM，He XB，et al.Analysis of Hedyotic diffusa in our hospital for anti－ tumor therapy[J].China Journal of Chinese Materia Medica(中國中藥雜志)，2006，(18):1 550 －1 552.

[2]Chiang LC，Chiang W，Chang MY，et al.Antileukemic activity of selected natural products in Taiwan[J].American Journal of Chinese Medicine，2003，31(1):37 －46.

[3]Fernandes J，Castilho RO，da Costa MR，et al.Pentacyclic triterpenes from Chrysobalanaceae species:cytotoxicity on multidrug resistant and sensitive leukemia cell lines[J].Cancer Letters，2003，190(2):165 － 169.