陜南薇菜中黃酮類化合物的提取及其抗氧化性研究

袁 亮，李開龍，溫松成，劉 歡，夏發軍，楊海濤

(陜西理工學院 化學與環境科學學院，陜西 漢中 723000)

薇菜是紫萁科多年生草本蕨類植物，其嫩葉含蛋白質、碳水化合物及鈣、磷等多種成分，其中的黃酮類化合物是廣泛存在于自然界的一大類多苯環化合物，主要成分蘆丁在生物體內具有抗癌、抗菌、抗炎、抗過敏、抗血管脆性和血小板聚集及抗糖尿病并發癥等多種生理活性及藥理作用。此外，黃酮具有抗氧化作用，可以增強肝細胞抗氧化酶活性，穩定線粒體膜電位，減少活性氧產生，其毒性遠低于合成氧化劑［1］。調查顯示:薇菜總黃酮還原能力較強，可以清除 O2－·、·OH 和 DPPH·自由基，且對脂質過氧化的抑制活性較強［2］。本實驗將通過正交試驗的方法，探究薇菜中黃酮類化合物提取的最佳工藝，為其進一步開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 試材

新鮮的薇菜，采自陜西省南鄭縣漢山鎮，自然風干后粉碎，過50目篩，于50℃烘箱干燥至恒重后備用。

1．1．2 主要試劑

蘆丁標準樣品(自制)。

無水乙醇、可溶性淀粉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、硫代硫酸鈉、碘化鉀、硫酸、過氧化氫等均為分析純。

1．1．3 主要儀器

722-E型紫外可見分光光度計(上海天普分析儀器有限公司)，FA-2004型電子分析天平(上海方瑞儀器有限公司)，DL-5型低速大容量離心機(北京時代北利離心機有限公司)，JH-9052型恒溫箱(中國重慶實驗設備廠)，HH-Z型恒溫水浴鍋(北京科偉永興儀器公司)和SHZ-Ⅲ型真空泵(西安明克斯檢測設備有限公司)。

1．2 實驗方法

1．2．1 薇菜中黃酮類化合物的提取流程

根據相似相溶的原理，把在乙醇中溶解度較大的黃酮類化合物從薇菜中分離出來，再利用離心分離祛除色素、蛋白質、膠體等大分子物質，其工藝流程如下:薇菜→烘箱烘干→碾碎→稱取適量→于恒溫水浴浸提→過濾→離心→定容→取上清液→測定吸光度［3］。

1．2．2 薇菜中黃酮類化合物的提取

取2.5 g薇菜干粉，在溫度、乙醇濃度以及料液比不同的情況下進行恒溫水浴，提取一段時間后過濾，所得溶液經離心后，用50 mL的容量瓶進行定容。

1．2．3 蘆丁標準曲線的繪制

精確稱取經干燥至恒重蘆丁標準品20.0 mg，加乙醇溶解并定容至50 mL，配成0.4 mg/mL的蘆丁標準溶液。準確吸取標準品溶液1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00、8.00、9.00 mL，分別加乙醇補至10.00 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1.5 mL，搖勻，靜置6 min，加10%的硝酸鋁溶液1.5 mL，搖勻，靜置6 min，加4%的氫氧化鈉溶液15 mL，用乙醇稀釋至刻度，搖勻，放置15 min，在波長510 nm處測定吸光度，以蘆丁濃度(mg/mL)為橫坐標，吸光度(A)為縱坐標，繪制標準曲線。得到回歸方程為:A=10.618C －0.0036，r=0.9952。

1．2．4 薇菜樣品總黃酮含量的測定

采用 NaNO2-Al(NO3)3比色法［4］，在 510 nm 處測定。

1．2．5 單因素實驗

設計溫度、浸提時間、乙醇濃度、料液比4個因素，分別進行3個水平的單因素實驗，確定最佳提取條件。

1．2．6 正交試驗

參照單因素實驗結果，設計4個因素3個水平的正交試驗，研究最佳提取工藝，見表1。

表1 正交試驗的因素水平

1．2．7 驗證實驗

稱取樣品薇菜粉末3份，每份2.50 g，按最優工藝條件進行總黃酮提取的驗證實驗，測定和計算黃酮的得率。

1．2．8 抗氧化性實驗

抗氧化值(artillery observation vehicle，AOV)的測定:利用過氧化氫與碘化鉀反應生成碘，再用硫代硫酸鈉滴定碘，設置空白對照就可以直接測定黃酮類化合物的抗氧化值。分別取不同濃度的薇菜黃酮提取液10 mL于三角瓶中，加入1 mol/L的硫酸0.25 ml和0.25 mol/L的H2O25 mL，室溫下反應10 min，再加入質量分數10%的碘化鉀溶液20 mL，靜置5 min后，用0.05 mol/L硫代硫酸鈉溶液進行滴定，以質量分數為1%淀粉溶液指示終點，同時用空白做對照，平行做三組，測定其平均值［5］。

2 結果與分析

2．1 單因素實驗

2．1．1 乙醇濃度對提取率的影響

稱取2.50 g薇菜樣品，按照1∶20的料液比分別加入濃度為50%、60%、70%、80%、90%的乙醇，于65℃恒溫水浴中浸提1.5 h，過濾，離心，測定其黃酮的含量，結果見圖1。

圖1 乙醇濃度對提取率的影響

由圖1可以看出，隨著乙醇濃度的升高，得率升高，但當乙醇濃度大于80%時，得率呈下降趨勢，可見乙醇濃度在80%左右時，提取率最高。

2．1．2 提取時間對提取率的影響

稱取2.50 g的薇菜樣品，按1∶20的料液比加入濃度為80%的乙醇，在65℃ 恒溫水浴中分別浸提 1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h，過濾，離心，測定其黃酮的含量，結果見圖2。

圖2 提取時間對提取率的影響

由圖2可見，隨著時間的延長，得率升高，但1.5 h以后，得率呈下降趨勢，所以當提取1.5 h時，提取率最高。

2．1．3 料液比對提取率的影響

稱取2.50 g的薇菜樣品，分別加入料液比為1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30 的 80% 的乙醇，于65℃ 恒溫水浴浸提1.5 h，過濾，離心，測定其黃酮的含量，結果見圖3。

圖3 料液比對提取率的影響

由圖3可見，隨著溶劑量的增加，提取率逐漸升高，但當料液比達到1∶25左右時，提取率最高。

2．1．4 提取溫度對提取率的影響

稱取2.50 g的薇菜樣品，按1∶25的料液比加入濃度為80%的乙醇，分別在60℃、65℃、70℃、75℃、80℃的恒溫水浴下浸提1.5 h，過濾，離心，測定其黃酮的含量，結果見圖4。

圖4 提取溫度對提取率的影響

由圖4可見，黃酮的提取率隨著溫度的升高而升高，但在65℃以上時，曲線呈下降趨勢，所以在65℃ 時，提取率最高。

2．2 黃酮提取的正交試驗

為確定乙醇提取工藝的最佳條件，設計如下正交試驗表進行實驗。

表2 正交試驗結果

由表2可知:各因素的影響大小為提取時間＞溫度＞料液比＞乙醇濃度;最佳的提取條件為A2B1C2D2，即提取時間為1.5 h，提取溫度為65℃，料液比為1∶25，乙醇濃度為80%。

2．3 驗證實驗

驗證實驗結果表明，總黃酮的平均得率為15.723 mg/g，高于正交實驗方案中的所有組合，說明工藝優化成功。

2．4 抗氧化活性分析

根據公式 AOV=(V0－V1)×M ×34/0.1，式中，V0為空白對照消耗硫代硫酸鈉的體積，V1為樣品溶液消耗硫代硫酸鈉的體積，M為硫代硫酸鈉的摩爾濃度0.05 mol/L，34為過氧化氫的摩爾濃度，0.1為常數，研究結果如圖5所示。

圖5 黃酮濃度對抗氧化值的影響

由圖5可以看出，在低濃度時，黃酮類化合物的抗氧化值隨其濃度的升高而升高，但當黃酮類化合物的濃度繼續升高時，曲線趨于平緩。這就是說，黃酮類化合物的抗氧化值隨其濃度的升高而升高，且先快后慢。

3 結論

薇菜中黃酮類化合物提取的最佳工藝條件為:乙醇的濃度為80%，料液比為1∶25，提取時間為1.5 h，溫度為65℃，在該條件下的得率為15.723 mg/g。

薇菜中黃酮類化合物具有一定的抗氧化性，且隨著添加量的增加，抗氧化作用增強，最后趨于平緩，達到最大值。

［1］陸柏益，張英，吳曉琴．竹葉黃酮的抗氧化性及其心腦血管藥理活性研究進展［J］．林產化學與工業，2005，25(3):120－124．

［2］童欣欣，方琴，陳靜波．四種常食用野菜總黃酮的測定及抗氧化活性的研究［J］．糧油食品科技，2010，18(5):43－46．

［3］游見明．生姜黃酮的提取方法比較［J］．四川食品與發酵，2005，2(4):88 －89．

［4］劉艷芳，楊焱，賈薇，等．藥用真菌桑黃總黃酮測定方法研究［J］．食用菌學報，2006，13(2):45 －52．

［5］張燦，張海暉，武妍．馬蘭黃酮類化合物的提取及其抗氧化活性［J］．農業工程學報，2011，27(2):307 －311．