左氧氟沙星對豚鼠心肌細胞電生理的影響

韋迎娜 韓圣娜 張 朝 (海南農墾三亞醫院心內科，海南 三亞 57000)

左氧氟沙星(LVFX)作為喹諾酮類藥物最常用的代表藥物，為氧氟沙星的左旋體，其抗菌活性約為氧氟沙星的2倍，它的主要作用機制為抑制細菌DNA旋轉酶活性，抑制細菌DNA復制。具有抗菌譜廣、抗菌作用強的特點，對多數腸桿菌科細菌，如肺炎克雷白菌、變形桿菌屬、傷寒沙門菌屬、志賀菌屬、流感桿菌、部分大腸桿菌、銅綠假單胞菌、淋球菌等有較強的抗菌活性;對部分葡萄球菌、肺炎鏈球菌、衣原體等也有良好的抗菌作用。偶見納差，惡心、嘔吐、腹瀉、失眠、頭暈、頭痛、皮疹及血清谷丙轉氨酶升高及注射局部刺激癥狀等，一般均能耐受，療程結束后即可消失。但臨床上喹諾酮類藥物對心臟不良反應的報道逐漸增多，本試驗旨在從動物大體水平和細胞離子通道水平〔1〕觀察LVFX對心臟的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 成年豚鼠(河南省實驗動物中心提供)，體重(300 ±50)g，雌雄不拘。

1.2 豚鼠心電圖的記錄 用20%的烏拉坦(5 ml/kg)腹腔注射麻醉豚鼠。待麻醉穩定后，將豚鼠仰臥位固定，用針形電極插入豚鼠的四肢皮下。使用BL-410生理軟件(成都泰盟科技有限公司)記錄豚鼠Ⅱ導聯心電圖。經腹腔注射鹽酸司帕沙星(SPX)50、100、200 mg/kg，分別記錄注射 LVFX 后 15、30、45、60、120、360 min的心電圖。測量心電圖的RR間期、QT間期并計算校正的QT間期(QTc)，QTc=QT×RR－1/2;腹腔注射生理鹽水作為對照組。根據“人和動物按體表面積折算的等效劑量比值表”，高劑量為200 mg/kg，中劑量為100 mg/kg，低劑量為50 mg/kg，每組5只。

1.3 豚鼠心室肌細胞的分離〔2〕在無麻醉的情況下迅速敲擊頭部致昏后，立即剖胸取出心臟，將跳動心臟置于4℃的無鈣臺氏液中洗去心腔中殘留血液，立即將心臟懸掛于Langendorff裝置上，并用動脈夾固定。首先用無鈣臺氏液進行主動脈逆行灌流;10 min后，換以含 Ca2+(0.025 mmol/L)、膠原酶(B型，0.37 g/L)和蛋白酶(XIV型，0.027 g/L)的低鈣臺氏液灌流10～15 min(液體溫度保持 36～37℃，灌流速度為2～3 ml/min)。待心臟膨松變大，呈現半透明的粉紅色，并且流出液為黏條狀，再用高鉀液(Glutamic acid 120，KOH 80，KCl 20，MgCl21，EGTA 0.3，HEPES 10，葡萄糖10 mmol/L)灌流10 ～15 min，沖洗殘留的含酶液。取心室組織，置于室溫的高鉀液中剪成碎塊，并用吸管緩慢地反復吹打使之分散。用200 μm微孔的尼龍網過濾除去結締組織及未消化心肌組織塊，濾液在室溫靜置約1 h，得到相對純凈的單個心室肌細胞。所用液體均預先充以純氧達到氧飽和，室溫保持在20～22℃〔3〕。

1.4 全細胞膜片鉗電流的記錄〔4〕取少許細胞懸液置灌流皿中，放于倒置顯微鏡的操作臺上，以正常臺氏液(NaCl 140，KCl 5.4，CaCl22，MgCl21，HEPES 10，葡萄糖 10 mmol/L)持續灌流細胞(流速1 ml/min)。使用記錄IK的電極內液，細胞外液中加入0.3 mmol/L CdCl2以阻斷Ca2+電流。細胞膜維持電位為－40 mV，使鈉通道和 T型 Ca2+通道失活。命令電壓在－10 mV～+80 mV之間，電壓階躍10 mV，時程5 s，采樣頻率0.25 kHz，刺激間隔15 s，得到各個鉗制電位下的IK電流值。

膜吸破后先記錄正常的IK的電流曲線作為對照，隨后，灌流液中加入 5 種不同濃度(1 ×10－7、1 ×10－6、1 ×10－5、1 ×10－4、1 ×10－3mol/L)的 LVFX 20 min 后，觀察用藥后電流的變化。IK為上述實測電流值;細胞膜電容Cm的計算公式為Cm=τ×I/V，其中I(pA)是電容電流的幅值，τ(ms)是未補償的電容電流衰減的時間常數，V(mV)為10 mV的恒定去極化脈沖。平均膜電容為(61.12±2.64)pF(n=120)，與文獻〔5〕(31～136 pF)一致。繪制電容電流-電壓關系曲線，觀察去極化程度逐漸增大時，電容電流的變化規律。同時，取+50 mV去極化水平，測量不同濃度藥物作用下，電容電流被抑制的百分率，然后繪制出藥物作用的量效曲線。以濃度的對數為橫坐標，加藥前后的比值為縱坐標，根據公式IC50=〔D〕/(1－I/Imax)－〔D〕得出LVFX的量效關系(其中D為藥物濃度)。

1.5 統計學方法 采用Oringin6.0軟件進行t檢驗和方差分析。

2 結果

2.1 豚鼠心電圖的改變 在注射200 mg/kg的LVFX時，豚鼠會出現不安、煩躁、嘔吐，甚至逐漸昏迷等中毒癥狀。隨著劑量的增加，LVFX引起QT間期延長也越明顯。見圖1。

圖1 LVFX對豚鼠心電圖QT間期的影響

在劑量為50、100 mg/kg時，LVFX引起QTc加藥前后自身對照差異無顯著性;當劑量為200 mg/kg時，LVFX引起的延長幅度差異顯著(P＜0.05)。見表1。

表1 LVFX對豚鼠心電圖R-R間期、QT間期、QTc的影響(±s，n=5)

表1 LVFX對豚鼠心電圖R-R間期、QT間期、QTc的影響(±s，n=5)

與加藥前比較:1)P＜0.05

濃度(m g/k g) 加藥前(m s)R-R Q T Q T c R-R Q T Q T c Q T c延長幅度(%)加藥后6 0 m i n(m s)生理鹽水 2 0 2.1 5±1 2.2 1 1 0 1.1 0±1 1.4 5 2 1 3.1 4±1 1.6 7 2 0 4.3 2±1 2.3 7 1 0 2.8 7±1 4.2 3 2 1 5.3 5±1 2.0 3 1.0 4±0.1 1 5 0 1 8 7.2 1±6.6 2 9 8.4 4±5.1 5 2 1 4.3 4±5.8 3 2 0 5.0 2±8.6 0 1 0 7.6 2±4.7 5 2 3 8.1 3±5.9 8 5.1 1±2.0 2 1 0 0 2 1 1.2 2±8.3 1 1 0 5.2 0±6.5 0 2 1 5.9 6±6.7 7 2 0 9.2 0±1 5.2 8 1 1 7.5 6±7.2 2 2 6 0.3 2±7.5 7 9.1 0±1.3 0 2 0 0 2 1 1.6 1±1 1.2 5 1 0 2.4 2±2.5 0 2 3 3.9 9±9.0 0 2 5 0.4 2±1 5.1 1 2 7.6 4±3.6 6 2 6 3.7 5±4.5 6 1 4.5 4±0.6 9 1)

2.2 LVFX對豚鼠單個心室肌細胞 IK(IK，step;IK，tail)的影響脈沖電流(IK，step)為一外向電流，激活緩慢，無明顯的失活，隨測試電壓去極化而逐步增大，呈時間依賴性和電壓依賴性;當脈沖刺激停止，復極到－40 mV時出現明顯的尾電流(IK，tail)，尾電流幅度較小，約為IK，step幅度的1/3。這些特征都符合IK電流的電生理特征。1×10－4mol/L的LVFX作用前、后，心室肌細胞的IK曲線的變化，LVFX作用后脈沖電流和尾電流均減小。+50 mV的測試電壓水平下，1×10－4mol/L的LVFX作用20 min前后IK減小。見圖2。

圖2 LVFX(1×10－4mol/L)對豚鼠單個心室肌細胞IK電流的影響

圖3可見明顯的 I-V曲線下移，即對 IK(IK，step;IK，tail)均有抑制作用。但這種抑制作用不影響IK原有的時間依賴性(IK，step)和電壓依賴性。幾乎所有測試電壓下LVFX作用后的IK均降低，且降低的程度隨測試電壓的去極化而增大，呈電壓依賴性改變。

在測試電壓為+50 mV時，LVFX的濃度分別為1×10－7、1 ×10－6、1 × 10－5、1 × 10－4、1 × 10－3mol/L，作用 20 min 后，IK，step依次從加藥前的(2.14 ±0.26)、(2.85 ±0.31)、(2.76 ±0.26)、(3.75±0.91)、(5.07±1.24)pA/pF減小到了加藥后的(1.88±0.24)、(2.46±0.32)、(2.25±0.31)、(2.24±0.61)、(3.26±0.96)pA/pF;其 IK，tail加藥前依次為(1.19 ± 0.05)、(1.29 ±0.18)、(1.04 ±0.26)、(1.21 ±0.24)、(2.19±0.56)pA/pF;加藥后依次為(1.12±0.07)、(1.14±0.16)、(0.86±0.22)、(0.95 ±0.17)、(1.18 ±0.35)pA/pF，可見LVFX對IK的抑制作用呈濃度依賴性。見表2。LVFX對IK的抑制呈濃度依賴性。見圖4。

表2 LVFX對豚鼠心室肌IK(IK，step，IK，tail)的抑制率(%，n=5)

圖3 LVFX豚鼠心室肌IK(IK，step;IK，tail)的I-V曲線

圖4 LVFX對IK抑制的量效關系曲線

3 討論

本實驗說明，在低劑量LVFX使用比較安全，而隨著劑量的增加，LVFX就有引起QT間期延長的潛在危險。心電圖上QT間期反映了心室肌去極和復極的總時程，反映到動作電位上則主要是動作電位時程的改變，尤其是復極3期的改變。

本研究提示LVFX對IK的抑制作用是呈濃度依賴性的，但這種抑制作用不影響IK原有的時間依賴性和電壓依賴性。這與文獻報道〔7〕第三代氟喹諾酮類抗菌藥LVFX等對人類ethera-go-go相關基因(HERG)電流密度的抑制作用呈濃度依賴性相一致。考慮為隨LVFX濃度的增加，單位膜電容上被抑制的IK電流也隨之增加，使動作電位復極過程中K+外流減少所致，但這種抑制作用不影響IK原有的時間依賴性和電壓依賴性。本文說明LVFX有較強的阻斷IK的作用，延長動作電位時程，誘發引起QT間期延長的現象。長QT綜合征(LQTS)是一種先天遺傳性，或者后天獲得的心臟復極延遲的疾病。長QT綜合征表現為心電圖上QT間期延長，它可以引起室性早搏及尖端扭轉性室速等致命性的心律失常，心源性暈厥和猝死為長QT綜合征常見并發癥。長QT綜合征患者心電圖上QT間期異常延長，臨床上長QT綜合征患者反復發生心源性暈厥、并常導致猝死的發生〔8〕。在臨床的使用中，尤其在患者心衰并肺部感染，易出現血鉀偏低情況，此時如果選用喹諾酮類藥物〔9〕進行抗感染治療，必須密切觀察患者血鉀情況，最高保證患者血清鉀在4 mmol/L以上相對安全，有文獻報道〔10〕，在嚴重的心肺疾病中，血鉀低可導致嚴重的惡性心律失常，原因多為 QT間期延長導致頻發間斷扭轉型室速，心室顫動最終導致死亡。因此，臨床醫生在對可引起長QT間期的藥物重視，喹諾酮類藥物就是在較大劑量是可引起長QT間期的一大類藥物。

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