和厚樸酚對人肺小細胞癌N446 細胞增殖與凋亡的影響

黃清松,李紅枝,鄭 敏

(廣東藥學院基礎學院,廣州 510006)

小細胞肺癌是一種惡性程度很高的腫瘤,其特點是生長迅速,早期容易全身轉移,發病率較高,流行病學[1]調查顯示,小細胞肺癌占全部肺癌的12%～15%。目前,臨床上多采用化療加放療相結合的方法進行治療,但用此法治療其毒副作用大,患者難以堅持。因此,尋找療效好而毒副作用低的藥物是目前腫瘤治療學方面的主要方向之一。

近年來,有研究[2-3]表明,厚樸根莖皮中的主要有效成分和厚樸酚,對多種惡性腫瘤細胞均具有比較明顯的抑制作用。研究和厚樸酚對某些腫瘤細胞的作用,例如人肺小細胞肺癌N446,探討和厚樸酚對人肺小細胞肺癌N446 細胞的增殖和凋亡的影響,可為和厚樸酚在臨床上應用于治療人肺小細胞肺癌提供實驗數據與理論依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 和厚樸酚,西安天一生物技術有限公司提供,產品批號:20110113,純度＞99%)。人肺癌細胞株N446 細胞,中國科學院上海細胞生物學研究所提供。RPMI 1640 培養基(GIBCO,USA,每L 含L-谷氨酰胺0.33 mg、10%小牛血清,鏈霉素100 U、青霉素100 U、pH 7.4);胰蛋白酶(MERCK,USA);分析純H2O2(鎮江市化學試劑廠,批號:20110311);四甲基偶氮唑鹽(MTT)(美國Sigma 公司)、二甲基亞砜(DMSO)和小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司提供),Annexin-V-FITC(PI)雙染色試劑(上海美季生物技術有限公司提供)。用二甲基亞砜(DMSO)將和厚樸酚溶解后,再用0.22 μm 尼龍濾膜過濾除菌得到母液,其濃度為100 mg/mL,放入冰箱-20℃冷凍避光保存,臨用前以RPMI 1640 培養液稀釋至所需濃度,其中的DMSO 濃度≤0.1%。流式細胞儀(BD FACSCalibur,美國)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 培養液RPMI 1640:pH=7.4,小牛血清含量為10%。人肺小細胞癌N446 細胞在RPMI 1640 中進行培養(條件:37℃、5%CO2的孵育箱)。每隔48 h 換1 次液,以1∶5 的比例進行傳代。

1.2.2 N446 細胞增殖抑制率 取對數生長期的N446 細胞,以RPMI 1640 培養液配制成1×105/mL 細胞懸液,每孔200 μL 接種于96 孔板上培養24 h,細胞貼壁后吸除培養液。1)實驗組每孔分別加入200 μL不同濃度的和厚樸酚(終質量濃度分別為2.5、5、10、20、40、80 μg/mL)。2)對照組加等量不含和厚樸酚的RPMI 1640 培養液。每組分別設有6 個復孔,按照上述常規培養方法分別培養24、48、72、96 h 后再進行MTT 實驗。實驗時每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)后再培養4 h 后,吸除上清液再每孔加150 μL DMSO,振蕩10 min,將酶標儀測調至492 nm 處測吸光度(A)值。3)采用MTT 法檢測,細胞增殖抑制率=(對照組A 值-實驗組A 值)/對照組A 值×100%。

1.2.3 凋亡率的檢測 用RPMI 1640 培養液將對數生長期N446 細胞制成1×106/mL 的細胞懸液,每孔1 mL接種于24 孔板上后再培養24 h 后吸去原來的培養液。1)實驗組每孔分別加入1 mL不同濃度的和厚樸酚(濃度分別為5、10、20 μg/mL)。2)對照組加入等量的RPMI 1640 培養液。每組均為3 個復孔。培養48 h 后離心收集細胞,用預冷的PBS 洗滌2 次,用結合緩沖液將細胞密度調為1×106/mL 后,取5 mL 至培養管內,加入Annexin-V-FITC 液5 μL、PI 液5 μL,置于冰箱內4℃避光反應30 min,用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

2 結果

2.1 和厚樸酚對N446 細胞增殖的影響 見表1。

表1 和厚樸酚對N446 細胞增殖的影響(吸光度,)%

表1 和厚樸酚對N446 細胞增殖的影響(吸光度,)%

注:與對照組比較,#P ＜0.05,##P ＜0.01。

2.2 不同和厚樸酚質量濃度對N446 細胞凋亡率的影響 見表2。

表2 不同和厚樸酚質量濃度對N446 凋亡率的影響(n=6)

3 討論

厚樸為木蘭科植物,其枝根皮可提取生物活性物質即和厚樸酚,具有多種藥理作用[2-3,11-12],尤其是在抗腫瘤方面的作用,由于其有誘導腫瘤細胞的凋亡、促進腫瘤細胞的分化、抑制腫瘤內新生血管的生長和抑制腫瘤細胞的轉移等多靶點、多途徑的抗腫瘤效應,加上其毒副作用小而倍受國內外關注。國外研究[4-5]顯示,和厚樸酚單獨或聯合應用可以抑制多種腫瘤細胞的增殖,并誘導其發生凋亡。國內研究[6-10]顯示,厚樸酚均具有明顯抑制癌瘤細胞的增長和誘導其凋亡的作用,且其引起抑制腫瘤細胞增殖和凋亡的機制與使癌瘤細胞阻滯于G1 期有關,從而使細胞周期失控,導致細胞增殖停止,發生細胞凋亡。

本研究結果顯示,和厚樸酚對人小細胞肺癌N446細胞具有明顯的抑制作用和誘導其凋亡的作用,從而提示,和厚樸酚對臨床上用于治療小細胞肺癌具有潛在的應用價值。本研究只對和厚樸酚對人小細胞肺癌N446 細胞的增殖和凋亡的影響作了一些初步的探討,但對和厚樸酚對人小細胞肺癌細胞作用的具體的分子機制仍有待于進一步深入的研究。

[1]Govindan R,Page N,Morgensztern D,et al.Changing epidemiology of small-cell lung Cancer in the United States over the last 30 years:analysis of the surveillance,epidemiologic,and end results database[J].J Clin Oncol,2006,24(28):4539-4544.

[2]Fried L E,Honokiol J L.Multifunctional antiangiogenic and antitumoragent[J].Antioxid Redox Signa,2009,11(5):1139-1148.

[3]劉麗,彭楓.和厚樸酚的抗腫瘤作用研究進展[J].華西醫學,2006,21(3):629-630.

[4]Deng J,Qian Y,Geng L,et al.Involvement of p38 mitogen-activated protein kinase pathway in honokiol-induced apoptosis in a human hepatoma cell line(hepG2)[J].Liver Int,2008,28(10):1458-1464.

[5]Liu H,Zang C,Emde A,et al.Anti-tumor effect of honokiol alone and in combination with other anti-cancer agents in breast Cancer[J].Eur J Pharmacol,2008,591(1-3):43-51.

[6]焦宗久.和厚樸酚對SP2/0 骨髓瘤細胞的作用觀察及其機制的初步探討[J].河北醫藥,2009,31(22):3065-3068.

[7]楊光麗,侯文禮,付阿富,等.和厚樸酚對人宮頸癌細胞增殖和凋亡的影響[J].四川大學學報(醫學版),2008,39(4):558-562.

[8]Johansson M,Persson J L,Jenny L.Cancer therapy:targeting cell cycle regulators[J].Anticancer Agents Med Chem,2008,8(7):723-731.

[9]田建超,陳建榮,季穎.半夏厚樸湯加味對抑郁癥模型小鼠碳廓清指數及胸腺淋巴細胞增殖的影響[J].吉林中醫藥,2010,30(1):78-79.

[10]李海波,谷建軍,英錫相,等.厚樸酚通過自噬途徑促進HepG-2 細胞死亡[J].長春中醫藥大學學報,2010,26(5):657-659.