加味四君子湯對lewis肺癌小鼠缺氧誘導因子-1α基因、CXC型趨化因子受體4基因及D-木糖的影響

李恒楠，包素珍

(浙江中醫藥大學，杭州 310053)

肺癌發病率和病死率高居各類惡性腫瘤之首，雖然新的靶向藥物及手術方式較以前有大幅度提高，但肺癌的5年生存率近20年沒有明顯改變[1]。缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)是缺氧條件下廣泛存在于哺乳動物及人體的一種轉錄因子。研究發現HIF-1α主要表達于肺癌細胞胞核及胞漿，呈現明顯的異質性，人正常肺組織無HIF-1α的表達，而肺癌組織中HIF-1α呈高表達[2]；CXC型趨化因子受體4(CXCR4)是近年來倍受關注的受體分子，主要表達于粒細胞、淋巴細胞和樹突狀細胞，在造血生成、器官發育、炎癥反應、淋巴細胞移行與歸巢及HIV感染中發揮著重要作用[3]。D-木糖廣泛用于檢測小腸吸收功能。中醫藥治療肺癌具有安全、毒副作用少等特點，能夠延長患者的生存期及提高其生存質量。本實驗旨在探討加味四君子湯治療肺癌的機制。

1 實驗材料

1.1 動物及瘤株 C57BL/6小鼠30只，雌性，6～8周，體質量(20±2)g,購自浙江中醫藥大學實驗動物中心；小鼠Lewis肺癌瘤株，由浙江中醫藥大學實驗動物中心提供。

1.2 藥物 加味四君子湯組成：生黃芪30 g，制半夏12 g，浙貝母12 g，白花蛇舌草30 g，茯苓15 g，炒白術20 g，黨參15 g，炙甘草10 g，共144 g。購自浙江中醫藥大學中醫門診部。

1.2.1 主要試劑及儀器 dNTP MIXture、M-MLV反轉錄酶、RNA提取試劑Trizol;Oligo d(T)、SYBR Premix Ex TaqTM購自大連寶生物工程有限公司，D-木糖，試劑盒購自南京建成生物試劑公司；全自動熒光Real-time PCR儀ABI 7500，購自美國ABI公司。

1.2.2 引物設計 HIF-1α上游引物gaggaaatgagagaaatgcttacac，HIF-1α下游引物cacactgaggttggttactgttg，CXCR4上游引物gcagcaggtagcagtgaaac，CXCR4下游引物gggttccttgttggagtcatag，GADPH上游引物tgcaccaccaactgcttag，GADPH下游引物ggatgcagggatgatgttc由大連寶生物工程有限公司合成。

2 實驗方法

2.1 模型制備 小鼠模型制備取傳代后第13天的C57荷瘤小鼠,脫頸椎處死，以酒精消毒操作部位皮膚，小鼠皮膚下剝取腫瘤組織，置于無菌平皿中；用消毒過的剪刀將腫瘤塊剪碎，置于研磨器中加生理鹽水輕輕研磨,過濾于200目篩網，制成瘤細胞懸液；顯微鏡下計數癌細胞數目，生理鹽水調整腫瘤細胞濃度為1×107個/ mL；用1 mL注射器取上述懸液0.2 mL注射于小鼠右腋部皮下。

2.2 組別及給藥 接種瘤株24 h后把小鼠分成3組，每組10只。A組為正常組;B組為接種瘤株肺癌組;C組為加味四君子湯治療肺癌組。小鼠等效劑量按《中藥藥理研究方法學》計算小鼠量為21.624 g/kg進行灌胃，1次/d，14 d，禁食不禁水12 h，第15天脫頸椎處死。

3 結果

3.1 加味四君子湯干預lewis肺癌小鼠后HIF-1αmRNA表達的影響 見表1。

表1 各組腫瘤組織HIF-1α的Ct值及2-ΔΔCt值比較(±s,n=10)

3.2 加味四君子湯干預lewis肺癌小鼠后CXCR4mRNA表達的影響 見表2。

表2 各組腫瘤組織CXCR4的Ct值及2-ΔΔCt值(±s,n=10)

3.3 各組小鼠血清中D-木糖含量比較 見表3。

表3 各組小鼠血清中D-木糖含量比較(±s,n=10)

4 討論

衛生部在全國范圍內開展第3次死因回顧抽樣調查，結果顯示我國肺癌病死率呈明顯增加趨勢，已成為癌癥致死第一位。而肺癌轉移是導致治療失敗、患者死亡的主要原因，研究[4]發現30%的患者在診斷時就已有遠處轉移，50%～60%在治療過程中出現遠處轉移，80%～90%患者死亡是由轉移引起的。“萬物沉浮于生長之門”，任何事物都離不開外界環境對其作用，腫瘤也不例外。在腫瘤轉移過程中,微微境中HIF-1α、CXCR4的作用尤其重要。據研究[4-5]發現，在肺癌等多種腫瘤組織中淋巴結有轉移組HlF-lα的表達強度顯著高于無淋巴結轉移組。Fan等[6]研究發現，腫瘤分期越晚，HIF-1α表達越高，且越是發生轉移的腫瘤組織，HIF-1α表達率就越高。另外HIF-lα還可以強力誘導趨化因子受體CXCR4，在轉移腫瘤細胞的定向遷移中起到關鍵作用。蘇麗萍等[7]在蛋白水平和mRNA水平檢測了CXCR4在臨床肺癌組織標本的表達，發現幾乎所有肺癌組織(鱗癌、腺癌及類癌等)都有較高水平的CXCR4表達。分子水平的分析顯示CXCR4的表達上調通過磷酸酯環已六醇激酶3/PTEN/AKT信號轉導途徑、缺氧誘導因子(HIF)-1α的激活、最終引起HIF依賴性CXCR4基因的轉錄調節。本實驗發現肺癌組和肺癌健脾組HlF-lα、CXCR4均有顯著差異，加味四君子湯由補氣方劑四君子湯加味而成，加黃芪增強補氣力量，加半夏、浙貝母軟堅散結,加白花蛇舌草抗癌。本實驗發現通過加味四君子湯干預后HIF-1α、CXCR4mRNA顯著下調。

D-木糖吸收水平能客觀反映小腸的表面積及其吸收功能[8]。因此，如果以定量木糖口服，在規定時間內測定木糖量，即可了解小腸吸收功能。通過檢測血清 D-木糖水平，可確定肺癌導致了小鼠吸收功能下降，然而肺癌健脾組和肺癌組比較,D-木糖沒有差異，這可能是用藥時間不夠有關,還需要進一步研究。D-木糖是反應脾氣虛的一個重要指標，以往研究[9-11]發現，“脾氣虛”對肺癌發展有重要影響，本實驗發現肺癌小鼠D-木糖含量降低，從而導致小鼠消化功能下降。

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