中波紫外線誘導小鼠皮膚急性光損傷模型中ASC和caspase-1的表達

胡 堅，楊閏平，李恒進，趙 華

解放軍總醫院 皮膚科，北京 100853

急性光損傷是皮膚對日光中中波紫外線(ultraviolet B，UVB)產生的一種急性炎癥反應，正常皮膚在單次過度照射UVB后即可引起這種局部炎癥反應。急性光損傷的機制及防治一直是人們普遍關注的問題，研究認為多種細胞因子參與了其發病過程。凋亡相關斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC)屬于死亡結構域超家族成員，由N端的熱蛋白結構域(pyrindomain，PYD)和C端的caspase募集結構域(caspase activation and recruitment domain，CARD)構成，在肺、肝、結腸、卵巢、皮膚、眼、白細胞和淋巴細胞等組織和細胞表達，在先天性和適應性免疫應答、炎癥反應、細胞凋亡及調節趨化因子的活性、淋巴細胞的趨化性、抗原的攝取和呈遞等方面具有一定的意義[1-2]，而半胱氨酸蛋白酶caspase-1作為ASC的一種常見下游因子參與了ASC引起的多種生理及病理過程[3]。Watanabe和Feldmeyer等發現ASC和caspase-1在UVB照射后的人角質形成細胞中表達增強，提示ASC和caspase-1可能參與了UVB所致急性光損傷的發病過程[4-5]。因此本實驗通過觀察ASC和caspase-1在UVB誘導的急性光損傷皮損中的表達，探討其在急性光損傷發病中的可能機制。

材料和方法

1 實驗動物 SPF級雌性BALB/c小鼠共30只，6~8周齡，體質量18~20 g。小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司(許可證編號：SCXK(京)2011-0004)，飼養于解放軍總醫院實驗動物中心。

2 試劑和儀器 小鼠ASC、caspase-1單克隆抗體，Abcam公司；UVB燈管(TL20W/12RS)， PHLIPS公司。

3 小鼠急性光損傷模型的建立 輻照計測定UVB燈管波長為280~320 nm，距離燈管20 cm處輻照強度為0.33 mW/cm2。固定照射距離為20 cm，根據輻射時間(s)=所需照射劑量(mJ/cm2)/輻照強度(mW/cm2)確定輻照時間。預實驗測定MED：將10只小鼠分為5組，每組2只，參考國內外文獻[6-7]，分別對耳部照射30、90、150、300、600 mJ/cm2劑量的UVB，測得MED約為90 mJ/cm2。觀察不同劑量UVB照射小鼠耳部臨床和組織病理表現，實驗組鼠耳采用4倍MED即360 mJ/cm2劑量給予單次照射，表現與急性光損傷的表現一致[8-9]。實驗組操作如下：預熱UVB燈管5 min，將小鼠固定于工作臺上。小鼠隨機分為對照組和實驗組，每組10只，對照組不照射UVB，實驗組照射4倍MED劑量UVB。觀察實驗組的光損傷變化，于照射后24 h取小鼠耳。

4 免疫組化檢測皮膚ASC和caspase-1 分別取實驗組和對照組小鼠耳， 4%甲醛固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。采用Elivision法，2 μm厚度連續切片，高壓鍋加熱修復，雙氧水消除過氧化酶。分別滴加1∶100 ASC和1∶100 caspase-1一抗，4 ℃濕盒過夜后PBS洗3次，每次3 min，滴加二抗，室溫靜置20 min后PBS洗3次，再加三抗，靜置20 min，PBS洗3次。DAB顯色，蘇木精復染，脫水、透明、中性樹膠封片。以PBS代替一抗作陰性對照。

5 結果判定 由兩名醫生對免疫組化染色切片進行評估。在顯微鏡下觀察表皮細胞著色情況，每張陽性切片隨機選取5個高倍視野(×400)，各計數100個角質形成細胞中陽性細胞所占的百分比，根據陽性細胞比例，無陽性染色為0分、0~25%為1分、26%~50%為2分、51%~75%為3分、≥76%為4分；并按染色強度無、弱、中、強分別計為0~3分。綜合兩個指標將評分分為4級，0分為陰性、1~3分為弱陽性、4~5分為陽性、6~7分為強陽性。

6 統計學方法 應用SPSS17.0統計軟件，兩獨立樣本非正態分布定量資料采用Wilconxon秩和檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

圖1 左側為對照組小鼠，右側為實驗組小鼠Fig.1 Mice in the blank control group (left)and experimental group (right)

圖2 小鼠急性光損傷模型(HE×100) 對照組(左)；實驗組(右)Fig.2 UVB-induced light injury model in blank control group (left)and experimental group (right)(HE×100)

圖3 ASC在小鼠耳部皮膚的表達 對照組(左)；實驗組(右)Fig.3 Immunohistochemical staining showing expressions of ASC-like protein in blank control group (left) and experimental group (right)

圖4 caspase-1在小鼠耳部皮膚的表達 對照組(左)；實驗組(右)Fig.4 Immunohistochemical staining showing expressions of caspase-1 in blank control group(left) and experimental group (right)

結 果

1 小鼠皮膚急性光損傷模型 與對照組相比，4倍MED劑量UVB照射的實驗組小鼠24 h后耳部皮膚水腫、增厚，出現紅斑、毛細血管擴張。見圖1。組織病理改變，HE染色顯示表皮細胞增生、水腫、部分細胞空泡形成、核固縮，真皮乳頭淺層水腫、血管擴張、管周淋巴細胞浸潤。見圖2。臨床表現和組織病理均符合急性光損傷表現。

2 免疫組化結果 1)ASC在小鼠耳部表皮的表達：對照組小鼠耳部表皮部分細胞胞漿和胞核染為淺棕黃色，染色評分中位數為1.23；照射4倍MED的實驗組鼠耳部表皮細胞水腫，排列紊亂，表皮全層細胞胞漿和胞核染為深棕黃色，ASC表達增強，染色評分中位數為4.11，兩組間差異有統計學意義 (t=65.0，P＜ 0.01)。見圖 3。2)caspase-1在小鼠耳部表皮的表達：對照組小鼠耳部表皮部分細胞胞漿和胞核染為淺棕黃色，染色評分中位數為1.16；照射4倍MED的實驗組鼠耳部表皮細胞水腫，排列紊亂，染為棕黃色，且陽性染色細胞增多，caspase-1表達增強，染色評分中位數為1.59，兩組間差異有統計學意義(t=56.5，P＜0.01)。見圖4。

討 論

國內外雖不乏關于急性光損傷的研究，但目前尚未形成統一的動物模型，不同模型的差異主要表現在：1)實驗動物：國外最多采用SKH-1無毛小鼠，其優點在于皮膚裸露便于照射，且具有胸腺，免疫功能正常[6]。而國內多采用Balb/C小鼠剃毛后照射UVB[7]。2)照射部位：因小鼠背部體表面積較大，實驗多對背部進行照射。3)光源：采用日光模擬器或紫外熒光燈，UVB波長約為290~320 nm。4)UVB照射方法：國外SKH-1小鼠多采用UVB單次照射，劑量為 200、360、800 mJ/cm2不等[6]；Sumiyoshi等對C57BL/6J小鼠進行UVB 120 mJ/cm2(約為3.3MED)照射[8]。而國內多對Balb/C小鼠進行180 mJ/cm2單次或多次照射[7]。5)評判標準：以臨床表現為紅斑、水腫；組織病理表現為表皮細胞水腫、空泡形成、核固縮，表皮內或表皮下水皰形成，真皮血管擴張等為急性光損傷特征[6,8]。本實驗采用UVB單次照射Balb/C小鼠，選取毛發較少的耳部皮膚，借鑒國內外經驗，并根據測定的MED以及觀察劑量的小鼠耳部紅斑反應，確定采用4倍MED劑量，臨床及組織病理表現與急性光損傷基本符合，認為造模成功。

以往研究認為，UVB引起的急性光損傷主要表現為急性炎癥反應和細胞凋亡兩個方面。1)急性炎癥反應：UVB照射后誘導生成的ROS作為第二信使通過p38MAPK、ERK1/2信號轉導通路激活轉錄因子c-Jun、c-Fos、NF-kB，誘導角質形成細胞生成前炎性因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α，促進角質形成、細胞增殖及中性粒細胞、淋巴細胞等的浸潤；UVB還可激活環氧合酶COX-2，進一步誘導合成PGE2、VEGF、MMPs、ICAM-1、PECAM-1等，促進炎癥反應及血管生成。2)細胞凋亡：DNA可直接吸收UVB，在相鄰嘧啶堿基之間形成二聚體光產物。此外，UVB誘導生成過量的活性氧及氮簇，超過了機體的清除能力，引起多種形式的DNA損傷如單鏈斷裂、鏈間交聯、堿基修飾等。

研究顯示，ASC可通過多種途徑發揮生物學作用[2-3]：1)參與形成NLRP3炎癥小體以參與炎癥反應。2)通過寡聚形成超分子結構即焦亡小體調節細胞焦亡。3)參與細胞凋亡過程。在UVB引起的急性光損傷中，一方面低劑量UVB誘導產生大量ROS，并使細胞內Ca2+升高，ROS和Ca2+作為危險因子促使ASC參與形成NALP3炎癥小體。ASC作為接頭蛋白連接前caspase-1，使caspase-1自分裂、活化，并進一步促使前IL-1β和前IL-18裂解成為活性IL-1β和IL-18，誘導其他炎癥細胞因子如IL-6、趨化因子、黏附分子等的合成，放大局部炎癥反應[9]。另一方面，UVB也可能通過ROS增強ASC的表達誘導細胞焦亡。焦亡是新近發現的一種新的由caspase-1介導的伴有大量炎癥因子釋放的細胞程序性死亡方式，ASC寡聚形成超分子功能性復合體通過caspase-1促使DNA的降解，并可導致細胞膜的完整性喪失，從而使胞內容物釋放，加重炎癥反應[2]。本實驗結果顯示經4倍MED的UVB照射后，實驗組小鼠耳部表皮細胞ASC和caspase-1表達較對照組增強，提示ASC和caspase-1參與了小鼠急性光損傷的發病過程，具體機制有待進一步研究。

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