辛伐他汀和非諾貝特對非酒精性脂肪肝大鼠血清ATGL酶活性和TNF-α水平的影響

何 微，喻 陸，高德祿，張世俊

1南方醫科大學研究生學院，廣州 510515；2解放軍第305醫院，北京 100017

非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一類無過量飲酒史和其他明確肝損因素所致的以肝細胞大泡性脂變為主要病理改變的臨床綜合征[1]。NAFLD自被發現至今，其明確的發病機制仍不完全清楚。現得到普遍認可的是1998年提出的“二次打擊"學說[2]。該學說認為胰島素抵抗和脂質代謝紊亂形成的單純性脂肪肝是第一次打擊，在此基礎上各種原因所致的氧化應激(OS)與脂質過氧化(LP)損傷引起的炎癥、壞死甚至纖維化、肝硬化則是第二次打擊。最新研究已證明，在NAFLD的形成過程中，脂肪組織分泌的脂肪因子，如TNF-α在誘導和加重IR有重要作用[3-4]，參與NAFLD的“二次打擊”。脂肪甘油三酯脂酶(adipose triglyceride lipase，ATGL)是新近發現的一種可特異性脂解甘油三酯為甘油二酯的重要脂肪酶。有研究指出，ATGL可表達于肝臟并通過增強甘油三酯水解活性從而減輕脂肪肝[5]，

有學者認為，其有可能為治療NAFLD提供新的思路。現關于胰島素抵抗藥物治療NAFLD的報道較多[6-7]，而降脂藥物較少。辛伐他汀和非諾貝特是臨床上療效肯定的兩種降脂藥。因此，本研究以高脂飼料建立NAFLD大鼠模型，采用該兩種降脂藥物治療大鼠NAFLD，在其過程中觀察血清ATGL酶活性及TNF-α水平的變化以及兩者之間的關系，從而進一步尋求NAFLD的可能發病機理及探索新的治療靶點。

材料和方法

1 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠78只，7周齡，體質量210~230 g。實驗動物質量合格證明號：SCXK(京)2009-0007(由北京華阜康提供)。

2 高脂飼料配方 10%糖，10%豬油，73.7%普通飼料。該配方根據文獻[8]改良，由北京華阜康提供。4 ℃儲存。

3 實驗儀器和試劑 大鼠血清TNF-α(E02T0008)和ATGL測定試劑盒(E02A0893)購自上海藍基；Beckman DXC 800全自動生化儀；日本Olympus DP 72顯微鏡；美國BIO-RAD酶標儀(model 450型)。辛伐他汀片(杭州默沙東)；微粒化非諾貝特(法國利博福尼公司)。

4 實驗動物分組及處理 大鼠適應性喂養1周后，分為2組：正常對照組15只，飼以普通維持飼料(北京華阜康提供)；NAFLD組63只，高脂飼料25 g/d，自由飲水。12周末，禁食12 h內眥采血2 ml，檢測血脂。處死正常對照組大鼠2只和NAFLD組3只，取肝臟病檢證實造模成功后，將余下的NAFLD組大鼠隨機分為4組：1)NAFLD對照組15只；2)辛伐他汀組15只，給予辛伐他汀100 mg/(kg·d)灌胃治療；3)非諾貝特組15只，給予非諾貝特40 mg/(kg·d)灌胃治療；4)飲食組15只，給予等量0.9%氯化鈉注射液；除NAFLD對照組繼續飼以高脂飼料，其他3組均改飼普通維持飼料。治療4周后，下腔靜脈取血檢測相關指標并處死，提取肝組織病檢。

5 檢測項目和方法 1)血清FBG、TG、TC、AST、ALT、BUN、Scr在Beckman DXC 800全自動生化儀上測定，采用Beckman原裝試劑；2)組織學病檢：將新鮮肝組織置于10%甲醛中固定24 h，常規石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅染色，光鏡下觀察肝臟脂肪變性和炎癥活動情況，每張切片觀察5×200個視野；3)酶聯免疫吸附試驗(ELISA)定量檢測大鼠血清中TNF-α和ATGL含量。

6 統計學處理 應用SPSSl3.0軟件統計，計量資料以表示。多組間的多個樣本均數比較采用One-wayANOVA檢驗，總體方差齊時，兩兩組間比較采用LSD法檢驗；總體方差不齊時，多組間的多個樣本均數比較采用Kruskal-Wills檢驗，兩兩組間比較采用Dunnett's T3法檢驗。雙變量相關關系分析采用pearson直線相關分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 體重、肝濕重及肝指數變化 至16周末，與正常對照組相比，NAFLD對照組體重、肝濕重及肝指數均顯著升高(P＜0.01)；兩藥物組及飲食組肝濕重與肝指數均顯著低于NAFLD對照組(P＜0.01)；兩藥物組肝指數顯著低于飲食組(P＜0.05)，見表1。

表1 16周末各組大鼠體重、肝濕重及肝指數Tab.1 Body weight, liver wet weight, and liver index in different groups at the end of 16th week(-x±s)

2 血脂血糖及肝腎功水平 16周末，與正常對照組相比，NAFLD對照組血清TG、TC、FBG、ALT、AST、BUN、Scr均顯著升高(P＜0.05)；兩藥物組血清TG、TC、ALT、AST及BUN、Scr均顯著低于NAFLD對照組(P＜0.01)；兩藥物組的肝腎功恢復情況顯著優于飲食組(P＜0.05)，見表2。

3 病理學改變 至16周末，正常對照組大鼠肝色鮮紅，邊緣銳利，光鏡下肝小葉結構正常，肝細胞系排列清晰(圖1A)；高脂飼料喂養至12周末，NAFLD大鼠肝臟增大，色淺黃，邊緣變鈍切面油膩感，光鏡下肝竇狹窄，肝細胞氣球樣變，胞漿內充滿脂滴，以小泡性脂肪滴為主，伴少量炎細胞浸潤和肝細胞壞死(圖1 B1)；16周末，NAFLD大鼠肝臟腫脹明顯，色泛白，質脆，光鏡下重度脂肪變，肝小葉結構不顯，肝竇消失，胞漿內大量大泡性脂肪滴將胞核推向一邊，有些細胞膜破損，胞核固縮，伴有大量炎性細胞浸潤(圖1 B2)；經辛伐他汀治療后，大鼠肝臟接近正常，鏡下見少量脂肪變肝細胞，肝竇可見，無明顯炎細胞浸潤和肝細胞壞死(圖1C)；非諾貝特組大鼠肝臟腫脹不顯，局部有淺黃，鏡下見少中量變性肝細胞，肝竇可見，伴有少量炎細胞浸潤，偶見壞死肝細胞(圖1D)；飲食組大鼠肝臟較兩藥物組腫脹，局部淺黃，鏡下可見肝細胞中度脂肪變，為小泡性脂肪滴，伴少量炎細胞浸潤和壞死肝細胞(圖1E)。

4 血清ATGL酶濃度及TNF-α水平 至16周末，與正常對照組相比，NAFLD對照組血清ATGL酶濃度顯著降低、TNF-α顯著升高(P＜0.01)；相較于NAFLD對照組，兩藥物組大鼠血清TNF-α顯著降低、ATGL酶濃度亦明顯升高(P＜0.01)，其中，辛伐他汀組更為顯著；飲食組ATGL酶濃度和TNF-α水平雖然有所恢復，但差異無統計學意義 (表 3)。

5 直線相關性分析 直線相關分析結果顯示血清ATGL酶濃度與TNF-α呈高度負相關(r=0.948，P＜0.01)，見圖2。

表2 16周末各組大鼠相關生化指標Tab.2 Biochemical indications for different groups at the end of 16th week(-x±s)

討 論

非酒精性脂肪肝病(NAFLD)包括單純性脂肪肝、脂肪性肝炎和脂肪性肝硬化三種類型，其中30%的患者可逐漸演變成脂肪性肝硬化[9]。IR是NAFLD發生發展的“初次打擊”[2]，是關鍵環節。近年來研究發現，在NAFLD的形成過程中，由脂肪組織分泌的重要脂肪因子TNF-α，可隨血液直接進入肝臟，誘導和加重IR，促使單純性脂肪肝向脂肪性肝炎和脂肪性肝硬化演變[3-4]。本實驗證實了正常肝臟在高脂飲食介導下發展成為脂肪性肝炎的病變過程。模型組大鼠血清TNF-α水平顯著著高于正常對照組，也再次證實TNF-α參與了高脂飲食脂肪肝損傷過程[10]。

ATGL是新發現的又一啟動脂動員的脂肪分解酶[11-12]，其可特異性脂解甘油三酯，并具有轉酰基活性，對基礎狀態下脂滴大小和甘油三酯儲積具有重要調控作用。細胞學水平的研究表明[13]，TNF-α和胰島素均可明顯下調ATGL mRNA表達。本實驗數據顯示模型組大鼠經長期高脂飲食介導后，血清TNF-α較對照組顯著升高，而ATGL酶濃度顯著下降，并且兩者之間呈高度負相關。因此推測，這可能是由于高TNF-α水平下調ATGL mRNA表達而影響血清ATGL酶濃度水平。而ATGL酶活性降低進而參與了血脂異常和肝細胞脂肪變性過程。

本實驗采用臨床上療效肯定的降脂藥物辛伐他汀和非諾貝特來治療NAFLD模型大鼠。結果顯示，兩藥物組大鼠的糖脂紊亂、肝腎功能異常、肝臟增大、脂質沉積以及肝細胞脂肪變性和炎性細胞浸潤等均顯著減輕，說明這兩種藥物對大鼠是有效的。有研究發現，他汀類藥物與非諾貝特不僅可有效降脂，還有抗炎、抗血栓和改善內皮功能的作用[14-15]。此項實驗中的兩藥物組大鼠血清TNF-α顯著降低，證實了兩藥物均有一定的抗炎作用，這與文獻報道結果相似[14,16]，而菲諾貝特較辛伐他汀抗炎效果輕；并且相較于飲食組，兩藥物組血清TNF-α降低顯著，且ATGL酶活性更高。提示兩藥物能夠有效治療大鼠NAFLD，可能與提高了血清ATGL酶活性有關，而這可能是通過TNF-α的調控來實現的。本研究結果還發現，兩藥物對大鼠高血脂性腎損害也有一定的治療作用。

因此，ATGL可能成為治療NAFLD的又一新的靶點，為治療NAFLD提供了新的思路。

圖2 ATGL 和TNF-α直線相關分析Fig.2 Linear relation of ATGL with TNF-α

表3 16周末各組大鼠血清ATGL 與TNF-α水平Tab.3 Serum ATGL and TNF-αlevels at week 16(-x±s)

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