中國南海多棘海星水提物抗皮膚真菌的活性分析

華 影，唐曉磊，陳章權，于靜蕊

1遼寧醫學院，遼寧錦州 121001；2武漢大學基礎醫學院，湖北武漢 430071；3廣東醫學院廣東省醫學分子診斷重點實驗室，廣東東莞 523808；4遼寧錦州市中心醫院，遼寧錦州 121001；5阜陽職業技術學院，安徽阜陽 236031

海星(sea star)是常見的海洋生物之一。近年來已發現多種海星活性物質，如皂苷、甾醇、蒽醌、多糖、多肽、糖脂等，具有抗腫瘤、抗感染、抗心管病等作用[1-5]。課題組此前曾報道過南海多棘海星的提取物在NKT細胞激活以及抗腫瘤方面的研究工作[6-7]。國內對海星抗真菌的研究僅見膠州灣羅氏海星皂苷類物質抗酵母真菌的報道[8]，而海星抗皮膚真菌卻鮮有報道。因此本實驗做了對我國南海多棘海星提取物抗皮膚真菌的研究，報告如下。

材料和方法

1 材料 多棘海星(asteruzs rollestoni)采自中國湛江海域，由海南大學海洋學院方再光博士鑒定。紅色毛癬菌(tricophyton rubrum)5株，斷發毛癬菌(trichophyton tonsurans)和石膏樣小孢子菌(microsprum gypseum)各3株，由遼寧錦州市中心醫院皮膚科實驗室惠贈；馬鈴薯葡萄糖培養基(potato dextrose agar，PDA)購于青島海博生物技術有限公司；冷凍干燥機77520-01 Freezone b購自美國(Labconco公司)；Milli-Q超純水機；貝克曼-庫爾特波長掃描儀；96孔細胞培養板(Costar)；Bio-Rad TC-10細胞計數儀；Eppendorf培養箱；Agilent 1260型高效液相柱層析(HPLC)儀，Agilent ZORBAX GF-250型葡聚糖凝膠色譜柱(9.4 mm×250 mm，4 μm)和ZORBAX 300 Extend C18硅膠色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)均為美國Agilent公司產品，HPLC層析柱洗脫流動相所用甲醇、乙腈為色譜純，氟康唑(fluconazole)常州市第二制藥廠，批號930805。其余試劑均為國藥集團分析純。

2 海星水溶性成分的制備 取新鮮南海多棘海星，經粉碎、冷凍干燥、除脂等處理[6-7]，加入2倍體積的去離子水，于4 ℃環境中連續攪拌24 h，400目紗布過濾后收集海星水提液，10 000 g離心10 min，將水相提取液pH調整為7.4，并于-80 ℃儲存備用。

3 海星水提物特征吸收波長的確定 將提取的儲存液配制成3個濃度梯度，并以貝克曼波長掃描儀從190~900 nm進行連續掃描，對海星水提物中在某特定波長處有吸收峰的波長作為后續分離的檢測波長。

4 高效液相色譜法(HPLC)對水提物的分離 將水提物經過高效液相色譜儀(HPLC)連以葡聚糖凝膠柱ZORBAX GF-250分離手段進行初步分離，以pH 7.4的磷酸鹽緩沖液為流動相，調節柱溫箱為23 ℃，流速為1 ml/min，在213 nm波長處檢測。隨后利用高效液相色譜儀(HPLC)連以C18硅膠柱對首次分離的有效組分進一步分離。在ZORBAX 300 Extend C18硅膠色譜柱中以V水∶V乙腈∶V甲醇=60∶20∶20為流動相，調節柱溫箱為23 ℃，流速為1 ml/min，在213 nm處進行檢測。

5 抗真菌的活性檢測 配制新鮮產孢子液體培養基：含L-谷酰胺而不含重碳酸鹽的RPMI1640培養基，使用0.165 mol/L 3-(N-嗎啡啉)丙磺酸調至pH 7.0，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌備用。初次分離的冷凍干燥后，稱取并用新鮮的液體培養基調至0.1 mg/ml備用。將26 ℃培養10 d后的PDA培養基中注入含0.05%吐溫-80 ℃的0.9%氯化鈉無菌溶液，適度震蕩并用無菌玻棒摩擦菌落表面，用200目濾網除去菌絲，用Bio-Rad細胞計數器計數，最終以配制的含有不同分離組分的液體培養基調孢子濃度至105/ml備用。設置空白對照(僅含有培養基)、氟康唑陽性對照組(氟康唑用少許二甲基亞砜助溶終濃度為10 μg/ml)、陰性對照和各提取組分實驗組，每組同時設置3個復孔。將培養板置于30 ℃，濕度80%~90% RH的培養箱中靜置培養96 h后，重新計數各培養孔中的孢子濃度。并計算孢子生長率：(提取物實驗組待測孔讀數－空白孔孢子讀數/陰性孔讀數-空白孔讀數)×100%。在隨后對初次分離第3組分(FSF-3)抑制紅色毛癬菌的檢測中，用新鮮液體培養基將初次分離第3組分配制成終濃度分別為100 μg/ml、50 μg/ml、25 μg/ml、12.5 μg/ml、6.25 μg/ml、3.12 μg/ml、1.56 μg/ml、0.78 μg/ml、0.39 μg/ml， 其 余 組 別設置及操作同上。FSF-3經高效液相色譜連以C18硅膠柱分離各組分冷凍干燥后，稱量各組分并以新鮮液體培養基(上述)調至10 μg/ml、5 μg/ml、1 μg/ml進行抗菌檢測。其余組別設置及操作同上。

結 果

1 海星水提取物的波長掃描圖譜 將水提物配制成1 mg/ml、0.5 mg/ml、0.1 mg/ml 3個濃度，在190~900 nm每間隔1nm進行連續掃描，測得各波長的吸光度值，發現在213 nm處有峰值，見圖1。

2 海星水提取物經葡聚糖凝膠柱分離圖譜 在葡聚糖凝膠柱中以pH 7.4的磷酸鹽為流動相，調節柱溫箱為23 ℃，調節流速至1 ml/min，在213 nm處檢測，對海星水提取物各分離組分的響應度所繪制的峰圖，根據分離程度結合實驗需要分為5組主要成分，分別標記為FSF-1、FSF-2、FSF-3、FSF-4、FSF-5，見圖 2。

3 葡聚糖凝膠柱分離所得各組分抗真菌活性鑒定使用微孔稀釋法通過對96 h培養后各孔孢子濃度的測定，在同一菌種的藥物敏感性檢測中以(待測孔讀數－空白孔孢子讀數/陰性孔讀數-空白孔讀數)×100%表示其孢子生長率(表1)，以及FSF-3組分抑制紅色毛癬菌的劑量依賴性的檢測，結果顯示隨著FSF-3濃度的降低抑菌效果逐漸減弱，當濃度低于0.78 μg/ml則無明顯抑菌效果，見圖3。

4 FSF-3組分分離圖譜 以V水∶V乙腈∶V甲醇=60∶20∶20為流動相，并以流動相溶解FSF-3至濃度為1 mg/ml，調節柱溫箱為23℃，調節流速至1 ml/min，通過C18硅膠柱按照極性差異，在213 nm處進行分離。根據分離情況分為3個主要組分，分別標記為SSF-1、SSF-2、SSF-3，見圖4。

5 FSF-3再次分離所得各組分抗真菌活性鑒定微量稀釋法檢測不同濃度SSF-1、SSF-2、SSF-3組分對紅色毛癬菌的抑制作用，見表2。

圖1 三種濃度海星水提取物的波長掃描Fig.1 Wavelength scan of water-soluble extracts from Asteruzs rollestoni at 3 different concentrations

圖2 海星水提取物在葡聚糖凝膠分離柱中的色譜圖FSF1-FSF5： 第一分離組分至第五分離組分Fig.2 Chromatogram of water-soluble extract from Asteruzs rollestoni by sephadex column FSF1-FSF5: The first separated fractions 1-5

圖3 不同濃度海星水提物組分FSF-3對紅色毛癬菌孢子生長率的影響Fig.3 Effect of FSF-3 at different concentrations separated from Asteruzs rollestoni on growth rate of Tricophyton rubrum spore

圖4 海星水提物FSF-3組分經C18硅膠分離柱分離組分的色譜圖Fig.4 Chromatogram of FSF-3 separated by combined HPLC and C18 silicagel column SSF-1-3: secondary separated fractions 1-3

表1 葡聚糖凝膠柱分離各組分對三種真菌孢子生長率的影響Tab.1 Effect of every components from the separation of sephadex column on the growth rate of three kinds of fungal spore (n=3,%)

表1 葡聚糖凝膠柱分離各組分對三種真菌孢子生長率的影響Tab.1 Effect of every components from the separation of sephadex column on the growth rate of three kinds of fungal spore (n=3,%)

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表2 FSF-3經C18硅膠分離柱分離所得三個組分對紅色毛癬菌孢子生長率的影響Tab.2 Effect of 3 components separaed by C18 silicagel column on growth rate of Tricophyton rubrum spore (n=3, %)

表2 FSF-3經C18硅膠分離柱分離所得三個組分對紅色毛癬菌孢子生長率的影響Tab.2 Effect of 3 components separaed by C18 silicagel column on growth rate of Tricophyton rubrum spore (n=3, %)

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討 論

皮膚癬菌引起的淺部真菌感染一直是皮膚科臨床最常見的皮膚病[9]。目前臨床上使用的各種合成抗真菌藥物在一定程度上可以控制真菌的感染，然而其對人體均有一定的不良反應。本實驗首次對中國南海海域的多棘海星其體內水溶性物質的抗真菌活性展開研究，對海星水溶性物質進行分離并與常見的3種皮膚癬菌共培養進行抑菌活性檢測，旨在從中篩選出具有抗菌活性的成分。

本研究在對提取物各組分的抑菌活性檢測中使用了微量稀釋法，該方法優點是用藥量少，操作易標準化及可借助儀器判讀結果等。該技術已被推薦用于酵母菌的MIC測定，室間質控結果證明效果滿意[10]。中國醫科院皮膚病研究所于1997年首次報道了微量稀釋法在測定皮膚癬菌最低抑菌濃度的實驗研究[11]。實驗中發現，此液體培養基的應用可有效的產生豐富的真菌孢子而只有極少量的菌絲以滿足后續實驗要求。

本文先將海星水溶性成分通過葡聚糖凝膠柱，根據分子量大小進行初次分離。將初次分離的組分與3種真菌共培養的結果顯示，在初次分離的FSF-3組分中含有對紅色毛癬菌有較強抑菌作用的物質。紅色毛癬菌是臨床常見的皮膚癬菌，皮膚淺部真菌病60%以上是由紅色毛癬菌感染所致[9,12]。遂將FSF-3組分作為重點研究對象，追蹤具有抑菌活性的成分。對FSF-3的分離中使用了HPLC連接C18硅膠柱根據極性差異進行再次分離，經過物質分子量和極性的兩次分離，這樣保證了物質成分較為單純。對各分離組分的抑菌活性檢測中發現，FSF-3組分的MIC(middle inhibitor concentration)可達3.15 μg/ml，與同類提取物對紅色毛癬菌的抑菌濃度報道相比，其濃度顯著低于報道值[13-14]。而對FSF-3的進一步分離檢測發現，SSF-1組分對紅色毛癬菌的抑菌活性不明顯，而SSF-2及SSF-3對紅色毛癬菌均有一定的抑菌效果。推測SSF-2和SSF-3中可能存在著分子量大小接近而極性卻差異較為明顯的物質。然而對該活性組分的物質結構、性質等信息仍需進一步的鑒定，并擬在動物水平上驗證其抗菌活性。上述研究為研制新型的海洋抗真菌藥物提供了方向和切入點。

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5 Peng Y， Zheng J， Huang R， et al. Polyhydroxy steroids and saponins from China Sea starfish Asterina pectinifera and their biological activities［J］. Chem Pharm Bull （Tokyo）， 2010， 58（6）：856-858.

6 何素輝， 唐曉磊， 鄧亦峰，等.多棘海星乙醇提取物對小鼠血清IL-4和IFN-γ水平的影響［J］.細胞與分子免疫學雜志，2011，27（11）：1198-1200.

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8 樊廷俊，張錚，袁文鵬，等．水溶性海星皂苷的分離純化及其抗真菌活性研究［J］.山東大學學報：理學版，2008，43（9）：1-5．

9 張道軍，黃云麗，張衛衛，等．淺部真菌病2600例病原菌分析［J］.中國皮膚性病學雜志，2012，26（6）：501-503．

10 Shawar R， Paetznick V， Witte Z， et al. Collaborative investigation of broth microdilution and semisolid agar dilution for in vitro susceptibility testing of Candida albicans［J］. J Clin Microbiol，1992， 30（8）：1976-1981.

11 劉維達，王金燕，吳建明．微量稀釋法測定皮膚癬菌最低抑菌濃度（MIC）的實驗研究［J］.臨床皮膚科雜志，1997（4）：17-19．

12 Mukherjee PK， Leidich SD， Isham N， et al. Clinical Trichophyton rubrum strain exhibiting primary resistance to terbinafine［J］.Antimicrob Agents Chemother， 2003， 47（1）：82-86.

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