阿托伐他汀對氯化鋰誘導人臍靜脈內皮細胞Wnt信號通路相關因子表達的影響

申玉超，于曉玲，張秀梅

遼寧醫學院附屬第一醫院，遼寧錦州 121001

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是眾多心腦血管疾病共同的病理基礎，嚴重危害人類健康。近年來內皮損傷學說得到了多數學者支持，內皮功能不全被認為是AS發生機制中的始動環節，因而對內皮細胞損傷進行藥物干預治療，也成為心血管疾病領域研究的一個新的趨勢[1]。Lee等[2]激活內皮細胞的Wnt/β-連環蛋白(Wnt/β-catenin)信號通路，發現內皮細胞功能紊亂，單核細胞對血管內皮的黏附性增強，但內皮細胞黏附分子表達并未增加，因此推斷Wnt/β-catenin信號通路可能與AS的發生機制有關[3-4]。本文通過研究阿托伐他汀對氯化鋰誘導人臍靜脈內皮細胞Wnt信號通路相關因子Wnt1、β-catenin、dvl-1蛋白表達的影響，探討AS與Wnt/β-catenin信號通路的關系及阿托伐他汀抗AS的可能機制。

材料和方法

1 材料和試劑 人臍靜脈內皮細胞株(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)購 自 ATCC公司；胎牛血清、1640培養基、胰蛋白酶購自海克隆生物有限公司(北京)；Licl購自北京協生生物科技有限公司；阿托伐他汀原粉購自輝瑞公司；兔抗人Wnt1抗體購自巴傲得生物科技有限公司；鼠抗人β-catenin抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司；兔抗人dvl1抗體購自北京博奧森生物技術有限公司；NO試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

2 實驗細胞與分組 HUVECs的培養 用含體積分數10%胎牛血清的1640細胞培養液培養，體積分數5% CO2的細胞培養箱中，1~2 d換液1次。以0.25%胰蛋白酶消化及傳代，并在倒置顯微鏡下觀察細胞形態、選擇生長良好的4~6代的細胞用于實驗。細胞分為3組：1)空白對照組：細胞不加任何干預；2)Licl組：加入終濃度為20 mmol/L的Licl；3)阿托伐他汀組：加入終濃度為20 mmol/L的Licl+10 μmol/L的阿托伐他汀共同處理。各組經卵育24 h后，收集細胞及培養的上清液，觀察不同組Wnt1、β-catenin、dvl-1蛋白的表達及培養液中NO含量的變化。

3 HUVECs形態學觀察 倒置顯微鏡觀察各組處理24h后HUVECs的形態學變化。

4 HUVECs的NO含量 用硝酸還原酶特異性將NO3-還原NO2-，通過顯色深淺測定其濃度高低。吸取各組中的細胞培養液，按南京建成生物工程研究所的試劑盒說明書進行檢測。

5 免疫組織化學法檢測蛋白的表達 將第4代細胞接種在有蓋玻片(多聚賴氨酸處理好)的6孔板中進行細胞爬片。4 ℃10%甲醛固定30 min，30%H2O21份+純甲醇9份室溫浸泡15 min，封閉液37 ℃孵育30 min，加兔抗人Wnt1、鼠抗人β-catenin、兔抗人dvl-1抗體(1∶600)于4 ℃過夜;加二抗A液37 ℃卵育30 min，加二抗B液37 ℃孵育30 min，顯色、復染。以上每步之間用PBS沖洗3次，每次4 min；顯色、復染，脫水、封片。鏡下觀察蛋白表達。

6 Western blot法檢測蛋白表達 收集各組細胞，超聲裂解細胞，4 ℃ 1 000 g離心2 min，取上清液，用考馬斯亮藍法蛋白定量。取20 μl蛋白質樣品行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，分別滴加兔抗人Wnt1、鼠抗人β-catenin、兔抗人dvl-1(1∶400)抗體，4 ℃孵育過夜，相應堿性磷酸酶標記的二抗室溫孵育2 h，堿性磷酸酶法顯色。于掃描儀上成像，并用GENE GENIUS軟件對條帶進行灰度值半定量進行分析。以肌動蛋白(β-actin，分子量為43 kU)為內參照，Wnt1(分子量為40 kU)、β-catenin(分子量為92 kU)及dvl-1(分子量為76 kU)與β-actin條帶灰度值的比值代表各蛋白表達的相對量。

7 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件，計量資料用-x±s表示，組間差異采用單因素方差分析，組間兩兩差異采用SNK檢驗。P＜0.01為差異有統計學意義。

圖1 倒置顯微鏡觀察各組的形態學變化

圖2 免疫組化法檢測各組Wnt1、β-catenin、dvl-1蛋白表達 A：Wnt1抗體； B：β-catenin抗體； C：dvl-1抗體

結 果

1 HUVECs形態學觀察 對照組細胞倒置顯微鏡下呈單層鋪路石狀鑲嵌排列，互不重疊，細胞邊界清晰，呈多角形；Licl組細胞收縮變圓，細胞間隙增寬，邊界不清，部分細胞脫落；阿托伐他汀組細胞間隙較Licl組窄，細胞形態趨于對照組。見圖1。

2 各組HUVECs的NO含量比較 與對照組比較，Licl組及阿托伐他汀組細胞培養的上清液中一氧化氮含量顯著減少(P＜0.01)；與Licl組比較，阿托伐他汀組細胞培養的上清液中一氧化氮含量顯著減少(P＜0.01)。見表1。

3 各組Wnt1、β-catenin、dvl-1蛋白表達 利用免疫組化法檢測，對照組Wnt1、β-catenin、dvl-1蛋白在細胞質內出現棕黃色淡染顆粒；與對照組比較，Licl組細胞質內出現大量棕色顆粒聚集、濃染；阿托伐他汀組較對照組細胞質內出現較多棕黃色顆粒，但較Licl組棕黃色顆粒明顯少。見圖2。利用Western blot法檢測，與對照組相比，Licl組和阿托伐他汀組Wnt1、β-catenin、dvl-1蛋白定量明顯上升(P＜0.01)；與Licl組相比，阿托伐他汀組Wnt1、β-catenin、dvl-1蛋白定量明顯降低(P＜0.01)。見表1、圖3。

表1 各組HUVECs的NO含量及Wnt1，β-catenin，dvl-1表達的比較, n=6)

表1 各組HUVECs的NO含量及Wnt1，β-catenin，dvl-1表達的比較, n=6)

aP＜0.01，與對照組相比較；bP＜0.01，與Licl組相比較

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圖3 Western blot法檢測各組HUVECs的Wnt1，β-catenin， dvl-1蛋白表達電泳圖

討 論

Wnt信號通路至少分為3個分支[5]：經典Wnt信號 通路(Wnt/β-catenin信號通路)，Wnt/JNK信號通路，Wnt/Ca2+信號通路。通過上述途徑影響細胞的增殖，分化及凋亡。本研究主要探討Wnt/β-catenin信號通路，正常情況下此通路處于關閉狀態，當被激活時Wnt蛋白表達增多，與其受體卷曲蛋白(frizzled)結合，激活dvl-1，使糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)活性受抑制，胞內β-catenin水平升高，入細胞核識別淋巴樣增強因子/白細胞增強因子(Tcf/Lef)[6-7]。β-catenin入細胞核形成Tcf-β-catenin復合物，它可與鈣黏蛋白啟動子區結合，從而下調鈣黏蛋白的表達[8]。鈣黏蛋白表達減少，使內皮細胞間黏附功能下降，細胞間縫隙形成、通透性增加，從而導致炎癥細胞侵入血管內皮下致AS形成。有報道證實了Wnt/β-catenin信號通路在內皮細胞黏附連接重建中居于重要地位[9-10]。Lee等[2]激活內皮細胞的Wnt/β-catenin信號通路，發現內皮細胞功能紊亂，單核細胞對血管內皮的黏附性增強，但內皮細胞黏附分子表達并未增加。綜上推斷Wnt/β-catenin信號通路激活與AS的形成有關。

阿托伐他汀是3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HUG-CoA)還原酶選擇性抑制劑，是廣為應用的他汀類藥物，其除有降脂作用外，還具有獨特的心血管疾病防治作用。Haidari等[11]發現阿托伐他汀通過抑制血管內皮細胞鈣黏蛋白酪氨酸磷酸化保護內皮細胞間的黏附功能。

本研究通過Wnt信號通路激活劑Licl誘導HUVECs，發現內皮細胞分泌的NO明顯減少，同時Wnt1、β-catenin、dvl-1蛋白表達明顯升高，證明在這一過程Wnt/β-catenin信號通路激活。在Licl誘導HUVECs的同時加入阿托伐他汀，發現內皮細胞分泌的NO明顯增加，同時Wnt1、β-catenin、dvl-1蛋白表達明顯降低，證明在這一過程Wnt/β-catenin信號通路被抑制。本研究證實了Wnt/β-catenin信號通路激活可能與AS的形成有關，而阿托伐他汀抗AS可能與其抑制Wnt/β-catenin信號通路有關。

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11 Haidari M， Zhang W， Chen Z， et al. Atorvastatin preserves the integrity of endothelial adherens junctions by inhibiting vascular endothelial cadherin tyrosine phosphorylation［J］. Cell Res， 2012，318（14）： 1673-1684.