丙戊酸鈉對利福平依賴結核菌的抑制作用

董 梅，王 迪，楊彩娥，孟祥紅，雷 紅，何菊芳，匡鐵吉

解放軍第309醫院 檢驗科，北京 100091

某些結核分枝桿菌臨床分離株在一定濃度的利福平作用下，不僅不會被抑制，反而生長得更快、更旺或更多，這被稱為利福平依賴現象[1-3]。曾有研究表明，藥物依賴現象在體外原代培養時較為突出，而傳代后卻不穩定，即使在含利福平的培養基上傳代，其依賴性也迅速減弱，甚至完全消失。這提示，表觀遺傳機制在藥物依賴結核菌中起著重要的作用，針對表觀遺傳途徑的抑制劑，可能成為抗利福平依賴性結核的特效藥物。我們近期研究發現，組氨酸乙酰化抑制劑丙戊酸鈉(valproate acid sodium，VPA)，在培養基水平對利福平依賴現象起明顯抑制作用。本研究組曾建立了穩定的利福平依賴結核病小鼠模型，為進一步研究提供了參考依據。本文旨在通過利福平依賴結核病小鼠模型，研究丙戊酸鈉在體內對利福平依賴結核菌的作用，為臨床抗結核提供新的思路和方法。

材料和方法

1 菌株 結核分枝桿菌利福平依賴株及耐藥株分離于解放軍第309醫院結核病研究所病人痰標本并經多重PCR鑒定為人型結核分枝桿菌；標準菌株來自于北京結核病防治所。將原代各菌株轉種，收集第三代斜面生長物備用。

2 試藥和試劑 利福平膠囊購自成都錦華藥業有限公司；丙戊酸鈉購自湖南省湘中制藥有限公司；瓊脂粉、可溶性淀粉、氫氧化鈉均為國產分析純；小牛血清購自浙江金華清湖犢牛利用研究所。匡氏培養基由本室自制，具體操作詳見早先報道[4]。

3 動物及分組 SPF級近交系BALB/c小鼠6~8周，體質量16~19 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號：SCYK(京)2002-0003。將雌性小鼠分成四大組，每組32只，分別為攻毒依賴株組、耐藥株組、標準株組小鼠及陰性對照組；對于每一大組，按照利福平治療組、VPA治療組、VPA與利福平聯合治療組、不治療組分為四組，每組8只小鼠。將菌株分別配制成1×106CFU/ml，每只取0.2 ml小鼠尾靜脈注射，對照組注入等體積的氯化鈉溶液。利福平與VPA每周給藥2次，劑量分別為：利福平1.3 mg/只小鼠；VPA 10 mg/只小鼠。每天觀察小鼠生理狀況。

4 肺組織荷菌量與依賴性測定 于第6周稱重后處死全部小鼠，無菌條件下解剖，取小鼠左肺至無菌研磨器內加一定量氯化鈉溶液磨至勻漿，做10倍系列稀釋，各組取 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5稀釋度，接種于不含藥匡氏培養基和含利福平的匡氏培養基各3支斜面，36.5℃培養，每周觀察依賴性，3周后進行菌落計數。

5 統計學方法 使用SAS8.1軟件對肺荷菌量進行統計學處理，肺荷菌量取對數值進行變量變換，定量資料采用析因設計定量資料的方差分析。

表2 實驗小鼠感染6周后肺臟荷菌量計數Tab.2 Tubercle bacilli load in lung tissues of mice 6 weeks after experimental infection(log10CFU,

表2 實驗小鼠感染6周后肺臟荷菌量計數Tab.2 Tubercle bacilli load in lung tissues of mice 6 weeks after experimental infection(log10CFU,

aP＜0.05, vs RFP(+)VPA(-)(resistant strains) group; bP＜0.05, vs RFP(-)VPA(-)(dependent strains) group; cP＜0.05, vs RFP(+)VPA(-)(dependent strains) group

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結 果

1 依賴結核菌小鼠的肺、脾臟器稱重 不治療的情況下，依賴株、耐藥株及標準菌株感染組間脾、肺重量無明顯差異；在利福平治療的情況下，依賴株感染組肺、脾重量明顯高于耐藥株及標準株(P＜0.05)。對于依賴株，利福平治療組肺、脾重量顯著高于不治療組(P＜0.05)，而耐藥結核菌中未觀察到同樣現象。見表1。

2 小鼠的肺臟荷菌量 在不治療的情況下，依賴株、耐藥株及標準株感染后，組織荷菌量無明顯差異；在利福平治療的情況下，依賴株感染組菌量明顯高于耐藥株及標準株(P＜0.05)。對于依賴株，利福平治療組菌量明顯高于不治療組(P＜0.05)，體現出菌株對利福平的依賴性；VPA與利福平聯合治療可有效降低肺部結核菌量(P＜0.05)，而單獨VPA治療對結核菌量并無明顯改變(表2)。說明VPA可以抑制結核菌對利福平的依賴性，對于耐藥結核菌及標準結核菌株，VPA并不能影響結核菌數量的改變。見表2。

表1 實驗小鼠感染6周后肺、脾稱重Tab.1 Lung and spleen weight of mice 6 weeks after experimental infection(g,)

表1 實驗小鼠感染6周后肺、脾稱重Tab.1 Lung and spleen weight of mice 6 weeks after experimental infection(g,)

aP＜0.05, vs RFP(-)VPA(-)(dependent strains) group; bP＜0.05, vs RFP(-)VPA(-)(dependent strains) group

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討 論

上世紀90年代初，本研究組在臨床結核菌實驗檢測和生理學研究中發現：很多臨床分離到的結核菌株，對常用抗癆藥物異煙肼、鏈霉素和利福平等存在生理性藥物依賴性，其主要特點是：在相當大的藥物濃度范圍內結核菌在含藥環境中生長得更快、更旺和更多。這種藥物依賴性在體外原代培養時尤為突出。結核菌這種藥物依賴性不是遺傳性的，雖然表型呈耐藥性，然而相關基因不存在突變。這可能是眾多耐藥基因檢測陰性耐藥株存在的原因。我國學者鐘敏等[5]、林紅巖[6]等從2000年起，對利福平賴藥結核菌的臨床表象及生物學特征進行了較詳細的研究，證明結核菌利福平賴藥性客觀存在，其對利福平的依賴是相對依賴，并明確利福平依賴肺結核以病情重、耐多藥、化療效果差和預后不良為主要臨床特征。本課題組近期建立了穩定的依賴結核菌株感染的BALB/c小鼠模型，發現結核菌依賴性在體內可以長期存在，這使進一步研究其作用機制和治療方法成為可能[7]。

隨著分子生物學技術的發展，人們發現組蛋白去乙酰化調控作為一種重要的表觀遺傳修飾，通過調節組蛋白乙酰化酶和組蛋白去乙酰化酶之間的動態平衡，參與了許多惡性腫瘤的發生發展。國際上曾有報道說：人體癌細胞藥物依賴現象為表觀遺傳調控[7-8]，但國際上尚未見到病原菌表觀遺傳研究報道[9-10]。VPA近期被證實是組蛋白脫乙酰酶特異性抑制劑之一，是研究表觀遺傳學作用的重要探針。本研究發現，利福平治療組依賴株感染結核菌量遠大于不治療組(6.27±0.88 vs 4.79±0.62，P＜0.05)，與先前的研究結果相符，證明依賴結核菌感染小鼠模型建立成功。利福平與VPA聯合治療組與單獨的利福平治療組相比，荷菌量大大減少(4.90±0.22 vs 6.27±0.88，P＜0.05)，說明VPA可以明顯抑制結核菌對利福平的依賴性，這種抑制在體外培養和動物體內都可以觀察到，說明利福平依賴性結核菌的形成機制與結核菌組蛋白乙酰化引起的表觀遺傳關系密切。這為研究利福平依賴結核菌的形成機制奠定了理論基礎，并為臨床治療相關疾病提供了新的思路。

1 楊彩娥，董梅，匡鐵吉，等．結核分枝桿菌利福平依賴株與耐受株差異蛋白的篩選與鑒定［J］ .解放軍醫學雜志，2009，34（9）：1124-1126，1136．

2 楊彩娥，趙利，王迪，等．結核分枝桿菌異煙肼依賴株與耐受株的耐藥性調查［J］.軍醫進修學院學報，2011，32（5）：453-454，470．

3 吳龍章，羅春明，吳幸怡，等．廣州市依賴藥物結核分枝桿菌分離率的初步調研［J］.中國防癆雜志，2011，33（1）：53-56.

4 匡鐵吉，宋萍，王利平，等. 分枝桿菌簡化瓊脂培養基的研究［J］.微生物學報，1995，35（4）：298-302.

5 Zhong M， Zhang X， Wang Y， et al. An interesting case of rifampicindependent/-enhanced multidrug-resistant tuberculosis［J］. Int J Tuberc Lung Dis， 2010， 14（1）： 40-44.

6 林紅巖，楊惠玉，廖暢隆，等. 耐多藥肺結核依賴利福平分支桿菌的實驗觀察［J］.中國防癆雜志，2003，25（z1）：46.

7 董梅，楊彩娥，雷紅，等．利福平依賴結核病小鼠模型的建立［J］.軍醫進修學院學報，2011，32（10）：982-983，989．

8 Ross SA， Milner JA. Epigenetic modulation and cancer： effect of metabolic syndrome?［J］. Am J Clin Nutr， 2007， 86（3）：s872-s877.

9 Wilson AS， Power BE， Molloy PL. DNA hypomethylation and human diseases［J］. Biochim Biophys Acta， 2007， 1775（1）： 138-162.

10 Migheli F， Migliore L. Epigenetics of colorectal Cancer［J］. Clin Genet， 2012， 81（4）： 312-318.