Apelin-13對葡萄糖剝奪乳鼠心肌細胞自噬的影響及機制

焦 慧，張 志，馬清華，付 偉

1遼寧醫學院附屬第三醫院 心內科，遼寧錦州 121001；2遼寧醫學院附屬第一醫院 心內科，遼寧錦州 121001

細胞自噬是真核細胞中普遍存在的生命現象，低水平自噬對心肌細胞起保護作用，而高水平或持久的自噬則加重細胞損傷導致細胞死亡。如何適時有效地抑制自噬，減輕心肌損害，已成為心血管疾病的研究熱點。Apelin是Tatemoto等[1]利用反向藥理學方法從牛胃分泌物中提取并純化的孤兒G蛋白偶聯受體(血管緊張素1型受體相關蛋白APJ)的內源性配體，在體內廣泛分布，尤其在心血管系統高度表達，具有降低血壓、改善心臟功能、減小心肌缺血再灌注損傷[2]及抑制心肌細胞凋亡[3]等多種心肌保護作用。研究發現，Apelin亞型之一Apelin-13還具有抑制心肌細胞自噬的作用[4]，但其作用機制尚未得到證實。本研究通過葡萄糖剝奪建立體外乳鼠心肌細胞自噬模型，在細胞水平上觀察Apelin-13對自噬的影響，進一步探討其可能的作用機制。

材料和方法

1 主要試劑及藥品 DMEM：F12(1∶1)培養基、5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)、PBS平衡鹽溶液(Hyclone公司)；小牛血清(杭州四季青生物工程材料公司)；胰蛋白酶(Byotime公司)；Apelin-13(北京康肽生物科技有限公司)，Tricribine、抗磷酸酪氨酸抗體(美國Santa Cruz公司)，兔抗人β-actin抗體、兔抗人LC3抗體、兔抗人Akt抗體、兔抗人p-Akt(Ser473)抗體、兔抗人mTOR抗體及兔抗人p-mTOR(Ser2448)抗體(Cell Signaling Technology公司)。

2 心肌細胞的培養及鑒定 標本取自出生1~3 d的Sprague-Dawley(SD)乳鼠(遼寧醫學院實驗動物中心)，無菌條件下，取出生乳鼠的心臟，用PBS平衡鹽溶液清洗3次后剪成1 mm3大小，用濃度為0.06%的胰蛋白酶于37℃恒溫磁力攪拌器中分次消化，每次6~10 min至消化完全，小牛血清終止消化。收集的細胞懸液以1 200 r/min，10 min離心，加入含15%小牛血清的DMEM∶F12(1∶1)培養基制成單細胞懸液，經200目篩網過濾，接種于25 cm3的培養瓶中，每組設6個平行組，置于37℃、5%的CO2培養箱中，靜置90 min。吸出細胞懸液并加入0.1 mol/L的5-溴脫氧尿核苷(BrDU)，混勻將細胞懸液稀釋成5×105/ml的細胞密度，接種于培養瓶，繼續置入培養箱中培養，每24 h換液1次。連續培養72 h后，選擇生長良好、搏動規律的細胞進入實驗。采用肌動蛋白單克隆抗體(α-Sarcomeric actin)進行心肌細胞鑒定。

3 實驗分組及模型建立 將上述培養72 h的心肌細胞隨機分為5組。1)正常對照組(Control組)：在其他組不同時間加入不同干預因素時，加入與干預因素等量的培養基，然后繼續按原培養基換液，培養12 h；2)葡萄糖剝奪組(GD組)：細胞換液前，操作同正常對照組，然后更換不含糖的DMEM∶F12(1∶1)培養基，建立葡萄糖剝奪誘導的乳鼠心肌細胞自噬模型，繼續培養12 h；3)Apelin-13預處理組(GD+Apelin-13組)：培養基中加入終濃度為1μmol/L的Apelin-13預處理30 min，其后同GD組；4)Tricribine+Apelin-13預處理組(GD+Tricribine+Apelin-13組)：培養基中加入終濃度為1μmol/L的Tricribine 30 min后，處理同GD+Apelin-13組；5)阻斷劑組(Tricribine組)：培養基中加入終濃度為1μmol/L的Tricribine 30 min后，處理同正常對照組。

4 透射電鏡下觀察自噬體 心肌細胞經上述處理后，吸去培養液后用PBS緩沖液輕柔洗滌3遍，細胞刮刮取細胞移入離心管，1 600 r/min離心30 min，仔細吸棄上清后得到細胞團塊，3%戊二醛及1%鋨酸雙重固定共3 h，PBS緩沖液漂洗30 min后，乙醇、丙醇逐漸脫水，環氧樹脂包埋，解剖顯微鏡下修塊，切片厚度1μm，醋酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛雙重染色。在透射電鏡下觀察心肌細胞的超微結構，選取典型視野拍照。觀察心肌細胞自噬體的形態及數量變化。

5 免疫沉淀脂質激酶分析法測PI3K活性 提取細胞總蛋白質，加入抗-磷酸酪氨酸抗體，孵育1 h后，加入G蛋白包被的瓊脂糖珠懸液繼續孵育4~12 h。充分洗滌G蛋白包被的瓊脂糖珠后，再用PI3K分析緩沖液洗滌1次。經洗滌過的抗原-抗體復合物加入50μl PI3K分析緩沖液，20μl脂質底物的混合液進行預孵育，加入10μl γ32PATP混合劑進行酶反應。10 min后加入等體積終止液終止反應，用磷酸化的脂類用氯仿-甲醇(1∶1)抽提2次，進行薄層層析及放射自顯影。采用FJ-2115型自動液體閃爍計數儀檢測放射性活度，以正常對照組平均放射性活度為100%標準，各組之間進行比較。

6 Western-blotting法檢測心肌細胞LC3、Akt、p-Akt、mTOR與p-mTOR的蛋白表達水平 所收集心肌細胞用預冷PBS洗滌2次，加入適量細胞裂解液，輕輕反復吹打混勻，冰上裂解20 min后，4℃、12 000 r/min離心20 min，取上清為總蛋白，用BCA法行蛋白定量。在各組樣品中取總蛋白50μg上樣，進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干法行蛋白轉膜，5% BSA-PBST室溫封閉1 h。LC3、Akt、p-Akt、mTOR及 p-mTOR和 β-actin一抗4℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h。經洗滌、顯影、灰度掃描后，以目的條帶和內參條帶β-actin的灰度比值分別表示Akt、p-Akt、mTOR及p-mTOR的蛋白表達水平。LC3是自噬標志性蛋白，有Ⅰ型和Ⅱ型之分，當哺乳動物細胞自噬發生時，LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉化明顯增加，因此常用目的條帶LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ的比值間接比較自噬率的多少。

7 統計學分析 采用SPSS13.0統計軟件處理，計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 透射電鏡下觀察自噬體 自噬體表現為包繞廢棄胞漿成分的雙層膜結構，發生自噬的細胞可見損傷的細胞器如線粒體的腫脹變性等，自噬體進一步與溶酶體融合、消化，可表現為空泡樣結構[5]。在相同單位視野下，GD組細胞內自噬體及空泡樣結構較正常對照組明顯增多；Apelin-13預處理后自噬體及空泡樣結構較GD組明顯減少；而Apelin-13聯合應用Tricribine后，自噬體及空泡樣結構較Apelin-13預處理組顯著增多；單獨阻斷劑組與正常對照組自噬體及空泡樣結構數量無明顯差異，見圖1。

2 LC3的表達水平 與正常對照組相比，GD組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值明顯增加(P＜0.01)；與GD組相比，GD+Apelin-13組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值明顯下降(P＜0.01)；與GD+Apelin-13組相比，GD+Apelin-13+Tricribine組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值明顯增加(P＜0.01)；Tricribine組與正常對照組相比，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值差異無統計學意義(P＞0.05)，見圖2。

圖1 透射電鏡下觀察心肌細胞內的自噬體(×8 000)箭頭所示：為包繞廢棄胞漿成分的自噬體； N：細胞核Fig.1 Transmission electron microscopy showing autophagosomes of cardiomyocytes in control group (A), GD group (B), GD+apelin-13 group(C), GD+apelin-13+tricribine group (D), ticribine group (E) (×8 000)Arrows indicate the autophagosomes wrapping cytoplasmic components. N: nuclei

圖2 Western-blotting法檢測 LC3蛋白表達水平Fig.2 Western-blot showing LC3 protein expression level in control group 1), GD group 2), GD+apelin-13 group 3), GD+apelin-13+tricribine group 4), ticribine group 5)aP＜0.01, vs control group; bP＜0.01, vs GD group; cP＜0.01,vs GD+apelin-13 group; dP＞0.05, vs control group

圖3 各組與對照組PI3K活性比較Fig.3 PI3K activity in control group 1), GD group 2), GD+apelin-13 group 3), GD+apelin-13+tricribine group 4), ticribine group 5)aP＜0.01, vs GD group

圖4 Western-blotting法檢測p-Akt與p-mTOR蛋白表達水平Fig.4 Western-blot showing expression level of p-Akt and p-mTOR protein in control group 1), GD group 2), GD+apelin-13 group 3),GD+apelin-13+tricribine group 4), ticribine group 5)aP＜0.01, vs GD group; bP＜0.01, vs GD+apelin-13 group

3 各組與對照組PI3K活性比較 與正常對照組(100%)相比，GD+Apelin-13組與GD+Tricribine+Apelin-13組PI3K的活性分別升高至159.72%、156.89%，差異均有統計學意義(P＜0.01)；其余3組與正常組差異無統計學意義(P＞0.05)，見圖3。

4 通 路 蛋 白 Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR的 表 達水平 葡萄糖剝奪的心肌細胞使p-Akt、p-mTOR的表達略有下降，但與正常對照組相比，差異無統計學意義(P＞0.05)；Apelin-13預處理30 min可明顯提高Akt與mTOR的磷酸化水平(P＜0.01)；而Apelin-13聯合應用Tricribine后Akt與mTOR的磷酸化水平又被顯著下調(P＜0.01)；另外，各組心肌細胞中總Akt與總mTOR蛋白表達水平無統計學差異(P＞0.05)，見圖4。

討 論

細胞自噬廣泛存在于真核細胞內，正常情況下，自噬維持在一個較低的水平。在缺血缺氧、養分缺失、氧化應激或感染等因素刺激下，細胞可啟動自噬來清除受損的細胞器，對細胞起到一定的保護作用，但是過度的激活自噬可導致細胞的死亡-Ⅱ型程序性細胞死亡[6]。因此適時干預自噬現象，可有效阻止受傷細胞向不可逆損傷方向發展。本研究中，我們用無糖無血清的培養基進行葡萄糖剝奪以誘導心肌細胞發生自噬[7]。

我們前期研究發現，Apelin-13可以明顯抑制GD誘導的心肌細胞自噬，并且具有濃度依賴性，在1μmol/L時效果最佳[4]。近期研究還發現，Apelin-13可以通過激活PI3K/Akt信號通路發揮抑制急性缺血誘導的大鼠心肌細胞凋亡的保護作用[8]。因此，本研究我們選用1μmol/L濃度的Apelin-13進行預處理，之前30 min給予Akt抑制劑Tricribine抑制PI3K/Akt信號通路的激活，觀察心肌細胞自噬及通路相關蛋白的變化，從而探討Apelin-13是否也可通過PI3K/Akt信號通路抑制心肌細胞自噬的發生。

研究證實，電子顯微鏡下觀察到自噬體是自噬發生的金標準[9]。另外，LC3是重要的自噬相關蛋白，有Ⅰ型和Ⅱ型之分，未發生自噬時，細胞內合成的LC3經過加工，成為細胞質可溶性的Ⅰ型LC3，當發生自噬時，LC3-Ⅰ經泛素樣加工修飾過程，與自噬膜表面的磷脂酰乙醇胺(PE)結合，形成Ⅱ型LC3。LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值與自噬體的數量呈正相關[10]。本研究表明：葡萄糖剝奪后乳鼠心肌細胞內自噬體數量顯著增多，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值明顯升高，表明心肌細胞自噬模型成功建立，與Matsui等[7]的研究結果一致；外源給予Apelin-13后，發現可以拮抗葡萄糖剝奪引起的自噬體增多及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高，說明Apelin-13抑制了自噬的發生；而Akt特異性阻斷劑Tricribine則部分逆轉Apelin-13對心肌細胞自噬的改善；另外，單獨應用Tricribine組與正常對照組相比，上述指標差異無統計學意義(P＞0.05)，說明1μmol/L濃度的Tricribine對心肌細胞自噬的影響較小。綜上提示我們，Apelin-13抑制心肌細胞自噬的作用可能與PI3K/Akt信號通路的激活相關。

自噬的發生機制主要包括：Ⅰ型PI3K/Akt/mTOR信號通路、mTOR信號通路、Ⅲ型P13K復合物及AMPK/eEF2激酶信號通路等，這些均參與調節自噬[11]。其中mTOR是一種進化上高度保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，參與調控細胞在營養條件改變時的反應及與能量新陳代謝有關的許多調節通路，位于PI3K/Akt通路下游，是自噬的門控機制，起負性調節自噬的作用[12]。細胞外受體的激活可使受體酪氨酸激酶殘基磷酸化，磷酸化位點識別并結合PI3K的p85調節亞單位，使Ⅰ型PI3K激活，PI3K激活后產生的PIP2、PIP3可結合Akt，導致Akt的磷酸化，磷酸化的Akt激活下游信號分子mTOR，從而抑制自噬的發生。我們的研究發現：Apelin-13能明顯提高PI3K的活性，促進Akt、mTOR磷酸化水平的升高；聯合給予阻斷劑Tricribine后，這種效應部分被消除，提示Tricribine顯著下調了Apelin-13誘導p-Akt、p-mTOR蛋白的表達。上述自噬現象的變化支持了我們的假說：Apelin-13激活了PI3K/Akt信號通路，同時激活其下游信號分子mTOR，發揮了抑制心肌細胞自噬的作用。然而在電鏡觀察與Western-blotting檢測中，我們發現：Tricribine抑制PI3K/Akt信號通路后，Apelin-13抑制自噬作用只是部分被消除，說明尚有其他機制參與。因此，Apelin-13抑制自噬的過程部分是通過激活PI3K/Akt/mTOR信號通路介導的。

綜上所述，Apelin-13可以抑制細胞自噬，其機制是部分激活PI3K/Akt/mTOR信號通路，抑制自噬相關蛋白LC3的表達及自噬體的形成，從而抑制損傷心肌細胞自噬的過度激活，提高心肌細胞的存活率。

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