厄貝沙坦預(yù)處理對(duì)心肌缺血再灌注損傷的影響

徐敬娟，趙鳳琴

遼寧醫(yī)學(xué)院，遼寧錦州 121001

隨著冠狀動(dòng)脈內(nèi)溶栓、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(percutaneous coronary intervention，PCI)等方法的廣泛應(yīng)用，再灌注治療成為急性冠脈綜合征的重要治療方法，與此同時(shí)再灌注損傷成為一大研究熱點(diǎn)。腎素-血管緊張肽-醛固酮系統(tǒng)(renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)在缺血再灌注損傷中起重要作用。國內(nèi)外已有許多實(shí)驗(yàn)證實(shí)，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(angiotensin converting enzyme inhibitor，ACEI)對(duì)心肌缺血再灌注具有保護(hù)作用。本研究通過制備大鼠心肌缺血再灌注損傷模型，觀察血管緊張肽Ⅱ1型受體阻斷劑厄貝沙坦對(duì)缺血再灌注損傷中腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)的影響及對(duì)梗死面積、心肌形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響，以探討在心肌缺血再灌注過程中，血管緊張肽Ⅱ1型受體阻斷劑厄貝沙坦對(duì)心肌保護(hù)作用的可能機(jī)制。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組 健康成年雄性SD大鼠38只，體質(zhì)量250~300 g，由遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，分籠飼養(yǎng)，自由飲水。隨機(jī)分成3組，假手術(shù)組6只(0.9%氯化鈉注射液2 ml/d)、缺血再灌注(I/R)組16只(0.9%氯化鈉注射液2 ml/d)、厄貝沙坦組16只(厄貝沙坦30 mg/(kg·d))，每天中午灌胃，預(yù)處理1周。假手術(shù)組開胸穿線不結(jié)扎冠脈，其余兩組通過結(jié)扎左室前降支45 min，松開結(jié)扎在灌注120 min建立缺血再灌注模型。

2 試劑和儀器 厄貝沙坦由修正藥業(yè)有限公司提供；丙二醛(MDA)試劑盒肌鈣蛋白(troponin I，TNI)試劑盒由南京建成生物工程研究所提供；ELISA IL-6試劑盒和TNF-α試劑盒由美國R﹠D公司提供。小型動(dòng)物呼吸機(jī)，小型動(dòng)物心電圖機(jī)，p6分光光度計(jì)，酶標(biāo)儀，顯微鏡，高速臺(tái)式離心機(jī)(美國Sigma公司)37℃恒溫水浴箱。

3 大鼠在體心肌I/R模型的建立 大鼠用20%烏拉坦(5 ml/kg)行腹腔麻醉后，接心電監(jiān)護(hù)儀檢測(cè)心電變化，氣管切開插管進(jìn)行呼吸機(jī)輔助呼吸(頻率60/min，潮氣量20 ml/kg)。于胸骨左旁3~4肋間行縱行切口，剪斷肋骨，破胸膜、心包膜，與冠狀動(dòng)脈左前降支0.2~0.3 cm處，用4.0Prolene線穿過動(dòng)脈，除對(duì)照組僅穿線不結(jié)扎外，其余兩組用一細(xì)小帶凹槽乳膠管墊于血管與結(jié)扎線之間，結(jié)扎45 min后沿凹槽剪斷結(jié)扎線，復(fù)灌120 min。結(jié)扎成功標(biāo)準(zhǔn)[1]：結(jié)扎線遠(yuǎn)端心肌顏色發(fā)紺，心電圖表現(xiàn)QRS增高增寬，ST段抬高。再灌注成功標(biāo)準(zhǔn)：缺血部位心肌顏色恢復(fù)，以標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)抬高的ST段下降50%以上。

4 心肌組織病理學(xué)觀察 將心肌置于10%甲醛溶液中固定，石蠟包埋后常規(guī)切片，HE染色，光鏡下觀察病理變化。

5 血清IL-6、TNF-α含量檢測(cè) 大鼠造模成功后，每組隨機(jī)取10只，用注射器在右心房取血2 ml，3 000 r/min離心10 min，分離血清，分成兩份，-80℃冰箱保存，待所有樣本收集完后，根據(jù)IL-6、TNF-α ELISA試劑盒說明書，檢測(cè)血清IL-6、TNF-α含量。

6 MDA、TNI含量檢測(cè) 按以上方法取血清后，按照說明書加試劑，用p6分光光度計(jì)檢測(cè)吸光度，根據(jù)公式計(jì)算血清MDA含量。血清中MDA含量=(測(cè)定管吸光度-測(cè)定空白管吸光度)/(標(biāo)準(zhǔn)管吸光度-標(biāo)準(zhǔn)空白管吸光度)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(10nmol/ml)肌鈣蛋白由生化全自動(dòng)分析儀測(cè)定。肌鈣蛋白由生化全自動(dòng)分析儀測(cè)定。

7 心肌梗死面積測(cè)定[2-3]除假手術(shù)組外，每組剩余6只大鼠再灌注后，重新結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支，經(jīng)尾靜脈將2% Evans blue 1ml注入，待大鼠口唇發(fā)藍(lán)后，迅速取下心臟，0.9%冰氯化鈉注射液清洗，剪去心房和右心室，濾紙吸干表面水分，置-20℃冷凍30 min，沿長軸切成2 mm的薄片5張，將切片浸入5% TTC的磷酸緩沖液中(pH 7.4)37℃孵育30 min，以區(qū)分缺血未梗死區(qū)(淺紅色)和梗死區(qū)(灰白色)，10%甲醛固定24 h，藍(lán)色為正常心肌，淺紅色為缺血未梗死心肌，灰白色為梗死心肌。用計(jì)算機(jī)圖像分析軟件Image-Pro Plus 3.0計(jì)算梗死面積占左心室面積的百分比。

8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 HE染色光鏡觀察(×400) A： 假手術(shù)組； B： 缺血再灌注組； C： 厄貝沙坦組Fig.1 Inflammatory cell infiltration(HE×400) in sham group(A), I/R group(B) and irbesartan treatment group(C)

表1 各組大鼠血清MDA、IL-6、TNF-α、TNI濃度及梗死面積的比較Tab.1 Serum MDA, IL-6, TNF-α, TNI concentrations and infarction area in different groups(

表1 各組大鼠血清MDA、IL-6、TNF-α、TNI濃度及梗死面積的比較Tab.1 Serum MDA, IL-6, TNF-α, TNI concentrations and infarction area in different groups(

aP＜0.01, vs group A; bP＜0.01, vs group B

?

結(jié) 果

1 大鼠心肌組織病理形態(tài)變化 假手術(shù)組：心肌結(jié)構(gòu)正常，心肌纖維排列整齊，無水腫、無炎細(xì)胞浸潤(圖1A)；缺血再灌注組：大范圍心肌纖維變性、斷裂，細(xì)胞核碎裂、溶解甚至消失，細(xì)胞空泡變性，細(xì)胞間質(zhì)高度水腫，明顯充血，中度炎性細(xì)胞浸潤(圖1B)；厄貝沙坦組：心肌纖維排列基本正常，可見少量細(xì)胞核碎裂與溶解，細(xì)胞間質(zhì)輕度水腫，少量炎細(xì)胞浸潤(圖1C)。見圖1。

2 厄貝沙坦預(yù)處理對(duì)大鼠相關(guān)指標(biāo)的影響 缺血再灌注組和厄貝沙坦預(yù)處理組血清MDA、IL-6、TNF-α明顯高于假手術(shù)組(P＜0.01)；厄貝沙坦預(yù)處理組明顯低于缺血再灌注組(P＜0.01)。缺血再灌注組和厄貝沙坦預(yù)處理組肌鈣蛋白明顯增高，厄貝沙坦組肌鈣蛋白低于缺血再灌注組(P＜0.01)。與缺血再灌注組比較厄貝沙坦預(yù)處理能夠明顯減少心肌梗死面積(P＜0.01)。見表1。

討 論

血管緊張素Ⅱ受體阻斷劑(angiotensinⅡreceptor blockers，ARBs)廣泛應(yīng)用于高血壓、心室重構(gòu)的治療，近年應(yīng)用于心肌梗死后的治療越來越多，有報(bào)道稱能減少再灌注心律失常的發(fā)生，降低心肌梗死病死率，對(duì)心肌缺血再灌注具有保護(hù)作用。

缺血再灌注后心肌組織的炎性反應(yīng)被證明是再灌注損傷的重要機(jī)制[4]。缺血再灌注組與假手術(shù)組比較，缺血再灌注120 min后，血清炎性因子IL-6、TNF-α明顯升高(P＜0.01)，說明炎癥因子IL-6、TNF-α參與了心肌缺血再灌注損傷，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。再灌注后心肌細(xì)胞損傷嚴(yán)重，且炎性細(xì)胞大量積聚，可能激活了炎性細(xì)胞如中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等合成并釋放大量的炎性因子[5](IL-6、TNF-α)，這些炎癥遞質(zhì)的升高又刺激中性粒細(xì)胞及心肌細(xì)胞表面黏附分子(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)的表達(dá)，誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞黏附穿過內(nèi)皮遷移至心肌缺血部位，造成對(duì)缺血部位炎細(xì)胞的浸潤及損傷，中性粒細(xì)胞可阻塞毛細(xì)血管，使心肌微循環(huán)的損傷程度加重[6]，增大梗死面積。IL-6、TNF-α主要由單核巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的一種具有多種生物活性的細(xì)胞因子，其水平與缺血后及再灌注后的損傷程度相關(guān)[7]，研究證明炎性因子(IL-6、TNF-α)的增加是心肌對(duì)損傷的一種應(yīng)激反應(yīng)，可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，增加心肌梗死面積。Neri Serneri等[8]報(bào)道雷米普利可顯著減少再灌注心肌TNF-α表達(dá)水平，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。

厄貝沙坦預(yù)處理組與缺血再灌注組比較，血清炎性因子IL-6、TNF-α顯著降低(P＜0.01)。損傷較缺血再灌注組明顯減輕，可能是由于厄貝沙坦減少了炎癥因子的合成和釋放，降低了炎癥因子引起中性粒細(xì)胞遷移浸潤，一定程度上阻止了惡性循環(huán)引起心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞。減輕炎癥反應(yīng)可減少微栓子阻塞、心肌細(xì)胞水腫、血管內(nèi)皮損傷及心肌梗死面積。厄貝沙坦預(yù)處理可以在一定范圍內(nèi)提高機(jī)體的免疫功能，維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，對(duì)心肌缺血再灌注損傷起到保護(hù)作用。有研究報(bào)道[9]血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)預(yù)處理后可使血清IL-6、TNF-α明顯減少，減輕心肌再灌注損傷。炎癥在心肌缺血再灌注損傷中起重要作用[10-11]。還有實(shí)驗(yàn)研究顯示替米沙坦能通過直接抑制脂肪細(xì)胞促炎因子的生成而發(fā)揮抗炎作用[12]。

氧化應(yīng)激也是心肌缺血再灌注損傷的主要機(jī)制之一[13]，MDA是氧自由基引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，其含量反映氧自由基水平和脂質(zhì)過氧化的強(qiáng)度和速度，是了解氧自由基致機(jī)體組織損傷的重要指標(biāo)之一。本實(shí)驗(yàn)表明，厄貝沙坦能抑制脂質(zhì)過氧化過程，減輕氧自由基對(duì)心肌的損傷。許多針對(duì)不同心血管疾病狀態(tài)的臨床研究都表明阻斷RAS可以減少炎癥作用和氧化應(yīng)激，這可能是降低心血管意外的重要因素[14]。

厄貝沙坦預(yù)處理后，肌鈣蛋白(TNI)降低，說明心肌細(xì)胞損傷較輕。TNI存在心肌中，心肌細(xì)胞壞死后釋放入血，是臨床上檢測(cè)心肌梗死的重要生化指標(biāo)。表明厄貝沙坦預(yù)處理可減少壞死心肌細(xì)胞和(或)對(duì)心肌細(xì)胞膜的通透性有保護(hù)作用。厄貝沙坦對(duì)心肌的保護(hù)作用可能有以下原因：1)當(dāng)心肌梗死時(shí)，RAS系統(tǒng)被激活，產(chǎn)生大量的血管緊張素Ⅱ通過AT1受體導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載、血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和中性粒細(xì)胞的激活，從而加重缺血再灌注心肌的損傷，厄貝沙坦可阻斷此作用，還可降低AT1受體的表達(dá)。2)加用厄貝沙坦阻斷AT1受體，導(dǎo)致血漿中增高血管緊張素II升高與AT2結(jié)合進(jìn)而激活緩激肽-NO途徑，增加心肌局部NO濃度[15]，擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、改善內(nèi)皮細(xì)胞功能、抑制血小板和白細(xì)胞在內(nèi)皮細(xì)胞黏附和聚集，減輕心肌損傷，減少梗死面積。3)此外，本實(shí)驗(yàn)研究，炎癥反應(yīng)在心肌再灌注損傷中起重要作用，厄貝沙坦可減少炎癥因子的合成或釋放，抑制炎癥反應(yīng)，減少脂質(zhì)過氧化，從而減輕心肌細(xì)胞的損傷。

總之，心肌缺血再灌注損傷的機(jī)制繁多且復(fù)雜，厄貝沙坦對(duì)心肌缺血再灌注有一定的保護(hù)作用，能減輕氧自由基的損傷，降低炎癥因子的合成和釋放，這可能是它減輕再灌注損傷的一個(gè)重要途徑，其確切機(jī)制需待進(jìn)一步研究。

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