氨基酸維生素對力竭游泳大鼠骨胳肌超微結構及相關酶的影響

惠華強，孫金山，徐紀平，肖立寧，黃 文，李兆申

疲勞是一種復雜的生理和心理現象，是機體腦力與體力活動過度，精神刺激過多，反復做某種單調活動所致。骨骼肌在運動性疲勞的發生、發展和損害中是最主要的靶器官，研究已證實疲勞進程轉歸與骨骼肌細胞的結構、酶學等變化密切相關［1-2］。氨基酸和維生素是維持人體生命活動必需的有機物，也是保持人體健康的重要活性物質，氨基酸和維生素的缺乏是導致和加重疲勞的主要原因之一，也是造成疲勞不能快速恢復的重要因素之一［3-4］。目前，關于氨基酸維生素制劑抗疲勞的研究報道較少，本研究將觀察氨基酸維生素制劑對游泳力竭大鼠骨胳肌超微結構及相關酶譜的影響，初步探討氨基酸維生素制劑緩解運動疲勞的作用和機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性SD大鼠36只，體質量200～220 g，購自第二軍醫大學實驗動物中心，分籠飼養，每籠6只。

1.2 主要試劑與設備 復方氨基酸膠囊(商品名為和安)，批號為091108，其組份為8種人體必需的氨基酸和11種維生素;氨基酸果糖粉固體飲料(商品名為萬和威力特)，批號為20091103，每袋15 g，配料為果糖、檸檬酸、谷氨酰胺、精氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、維生素C、食用香精、氯化鈉、活性鈣等，均為深圳萬和制藥有限公司產品。日立H-7650分析透射電鏡(日立公司產品)，大鼠腓腸組織中calpain-1、calpain-2、ubiquitin、一氧化氮合酶(NOS)檢測試劑盒(南京建成生物研究所產品)。

1.3 動物模型制作 采用數字表法將36只SD大鼠隨機分為3組:復方氨基酸膠囊組(膠囊組)，給予膠囊3粒溶于500 ml飲用水中;空白對照組(對照組)，給予普通飲用水;氨基酸果糖粉固體飲料組(沖劑組)，給予飲料30 g溶于500 ml飲用水中。所有動物給予國家標準嚙齒類動物飼料，自由攝食，動物房溫度21～23℃ ，相對濕度50% ～55%。所有動物實驗前均未受過任何刺激干擾，實驗前先給予適應環境飼養5 d。采用無負重游泳方式建立大鼠運動疲勞模型，實驗時間總長為14 d。在內壁光滑的泳池中進行訓練，水深50 cm，水溫(25±1)℃，每池次游泳大鼠6只，游泳過程中防止大鼠互相拽抱。第1～3天，游泳訓練時間為30 min;第4～6天，每天遞增10 min;第7～9天，每天1次力竭性游泳訓練;第10～14天，每天2次力竭性游泳訓練，2次間隔6 h。游泳力竭的標準:大鼠沉到水下10 s仍不能返回水面，出水后呼吸深急、幅度大，雙目無光，反應遲鈍，體位為俯臥或端坐，被握持時四肢下垂。

1.4 指標觀察 于末次力竭游泳結束后1 h(實驗第14天)進行，用2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，處死后立即取3組大鼠的右側腓腸肌組織，0℃下切成約1 mm3大小，經俄酸處理，環氧樹脂包埋，超薄(0.1 μm)切片，醋酸雙氧鈾染色，電鏡下觀察骨骼肌超微結構。冰袋上迅速分離腓腸肌，置－80℃凍存;精確稱重，冰浴中超聲粉碎成勻漿液，4℃靜置10 min，3000 ×g低溫離心15 min;取上清液，經0.22 μm微孔濾膜過濾后分裝，－80℃凍存待檢測。

1.5 統計學處理 采用SPSS 16.0統計學軟件進行數據分析。計量資料用均數±標準差()表示，組間比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 骨骼肌超微結構變化 膠囊組和沖劑組肌細胞胞質內線粒體和肌絲結構基本完整，肌纖維排列尚整齊，肌漿網組織清晰，未見斷裂和空泡樣變。對照組肌細胞明顯腫脹變性，線粒體可見不同程度損傷，伴有膜、嵴松散、彎曲、溶解、斷裂現象，甚至出現空泡化。見圖1。提示補充氨基酸維生素制劑可以有效地降低力竭疲勞造成的大鼠骨骼肌損傷，提高大鼠抗疲勞損害的能力。

圖1 3組大鼠骨骼肌超微結構變化(HE×15 000)

2.2 骨骼肌相關酶檢測 膠囊組和沖劑組大鼠腓腸肌組織中calpain-1、calpain-2和ubiquitin與對照組比較差異均有統計學意義(P＜0.05)，NOS與對照組比較差異也有統計學意義(P＜0.05)。見表1。

表1 3組大鼠骨骼肌相關酶檢測(μmol/g，)

表1 3組大鼠骨骼肌相關酶檢測(μmol/g，)

注:與對照組比較aP＜0.05;NOS為一氧化氮合酶

3 討論

疲勞，尤其是力竭運動所致疲勞的發生和發展過程中骨骼肌將消耗大量的能量，ATP是主要的供能物質，ATP水平對骨骼肌生理功能的維持和細胞生存是十分重要的，骨骼肌的收縮和舒張均需要細胞內ATP的消耗，Ca2+-ATP酶通過水解ATP而將細胞內Ca2+泵到肌漿網間隙中，當持續或過度肌肉收縮和舒張后，導致骨骼肌疲勞，可出現ATP儲備的降低、線粒體的“過勞”及其結構的破壞［5-6］。本研究中，筆者觀察力竭游泳疲勞大鼠模型線粒體超微結構，發現骨骼肌線粒體腫脹，并有不同程度損傷，伴有膜、嵴松散、彎曲、溶解、斷裂現象，甚至出現空泡化。提示線粒體作為將多種食物性底物轉化為化學能、產生ATP和熱能的主要細胞器，不僅在疲勞的發生、發展中扮演著關鍵角色，而且在預防和快速恢復疲勞的研究中也是重要的突破口。

Calpain是鈣激活中性半胱氨酸內肽酶，包括calpain-1、calpain-2和 calpain-3等多種同工酶。研究表明，calpain參與骨骼肌細胞內游離Ca2+濃度的調節，激活不同信號通路，發揮促進和愈合骨骼肌損傷的功效［7］。Ubiquitin是由76個氨基酸組成的多肽鏈，其序列具有高度保守特點，骨骼肌蛋白質在降解前需要多聚泛素鏈相連接，即產生蛋白質的泛素化。疲勞發生時，ubiquitin大量激活使蛋白質被特異性識別、結合并迅速降解［8］。NOS是一種同工酶，分別存在于內皮細胞、巨噬細胞、神經吞噬細胞及神經細胞中，在損傷修復和組織再生中起重要作用，可以催化產生一氧化氮(NO)，促進骨骼肌缺血損傷的修復［9］。本研究中，筆者對力竭游泳疲勞大鼠骨骼肌組織中calpain、ubiquitin和NOS進行檢測，結果發現伴隨骨骼肌線粒體的損害、ATP濃度降低，組織中calpain、ubiquitin升高，NOS降低，提示骨骼肌過度疲勞可導致組織的損傷及相關酶的變化。

氨基酸是與生命活動密切相關的蛋白質的基本組成單位，是人體必不可少的物質，氨基酸在運動過程中提供能量，且與運動能力有密切的關系。支鏈氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸等)是一類主要在肌肉中代謝的氨基酸。有研究表明，在動物或人體運動過程中補充支鏈氨基酸后，具有提高機體的運動能力、延緩疲勞的發生，加快疲勞恢復等作用［10］。研究也表明精氨酸是體內NO合成的前體物質，運動中可刺激機體分泌多種重要激素，同時在尿素循環中可加速氨排出體外、延緩疲勞發生［11］。本研究觀察到，給予適當的氨基酸和維生素制劑干預可以明顯減輕力竭疲勞大鼠骨骼肌的損傷，同時可以觀察到calpain、ubiquitin的降低和保護性物質NOS的增高。補充氨基酸維生素制劑對于預防和快速恢復力竭疲勞所致大鼠骨骼肌的損傷有明顯的作用效果，可能成為一種具有良好抗疲勞作用的遴選制劑。

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