突變型人PRKAG2基因的克隆及其真核表達載體構建

陳 挺，張必利，何 平，程 平，鄭 興

家族性心室預激、傳導系統病變及心肌肥厚在2002年首次被歸結為分子遺傳學疾病，并被統稱為PRKAG2心臟綜合征。這是一種少見的常染色體顯性遺傳性疾病，主要由于編碼腺苷-磷酸激活的蛋白激酶γ2調節亞單位基因的PRKAG2發生錯義突變，例如，有人認為該基因R302Q位點突變與預激有關［1-2］。患者會出現陣發性室上性心動過速，需安裝永久起搏器，同時有可能伴有心肌肥厚、左室功能障礙等臨床表型［3-4］。本研究擬通過構建含有突變位點R302Q的PRKAG2的真核表達載體，為進一步研究基因PRKAG2 R302Q突變的功能以及PRKAG2心臟綜合征的發病機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑

大腸桿菌感受態細胞Top10，由筆者所在實驗室制備;真核表達載體 pIRES2-EGFP(Clontech公司);KOD高保真DNA聚合酶(TOYOBO公司);限制性內切酶Nhe I、BamH I(Fermantas公司);T4DNA連接酶(NEB公司);普通質粒小抽試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和PCR清潔試劑盒(Axygen公司);Trizol試劑(Invitrogen公司);逆轉錄酶(Promega公司)。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與合成 設計用于PCR擴增人野生型PRKAG2基因(NCBI基因ID號51422)CDS區的引物，ATG起始位點前增加Kozak序列GCCACC，引物名稱及序列:F1，5'-GTCAGCTAGCGCCACCATGGGAAGCGCGGTTATGG-3';R1，5'-TGTAGGATCCTCACTCCGTTTCTGTCTCCTTTTGT-3';設計R302Q定點突變引物，突變位點位于引物中間位置，引物名稱及序列:RQ1，5'-GCCAACGGTGTCCGAGCAGCGCCACTGT-3';RQ2，5'-ACAGTGGCGCTGCTCGGACACCGTTGGC-3'，以上引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.2 人野生型基因 PRKAG2的克隆 用 Trizol法抽提健康人全血mRNA，逆轉錄合成cDNA第1條鏈，采用F1/R1特異引物PCR擴增目標序列，PCR 體系:cDNA 0.5 μl，F1 引物 0.5 μl，R1 引物0.5 μl，KOD DNA 聚合酶 0.5 μl，濃度 2 mmol/L 的dNTP 2 μl，濃度 25 mmol/L 的 MgSO41 μl，10 × KOD Buffer 2.5 μl，無菌雙蒸水加至 25 μl。反應體系在冰上配制，混勻，瞬時離心后置于PCR儀，95℃預變性 5 min 后;95℃變性30 s，55℃退火30 s，68℃延伸90 s，進行35個循環;最后68℃延伸5 min。目標片段回收，經Nhe I、BamH I雙酶切連接至pIRES2-EGFP載體中，篩選陽性克隆測序驗證。

1.2.3 人突變型基因 PRKAG2 R302Q的克隆(1)PCR分段擴增引入突變序列。以人野生型PRKAG2基因為模板，分別采用F1/RQ2、RQ1/R2 2對引物進行PCR擴增，擴增產物分別命名為RSa、RSb。擴增結束后將PCR擴增產物全部上樣，用1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下切割目的片段，膠回收試劑盒純化。PCR體系及反應條件:模板pPRKAG2-IRES2-EGFP質粒 0.1 μl，F1/RQ1 0.5 μl，RQ22/R1 0.5 μl，KOD DNA 聚合酶 0.5 μl，濃度 2 mmol/L 的 dNTP 2 μl，濃度 25 mmol/L 的 MgSO41 μl，10 × KOD Buffer 2.5 μl，無菌雙蒸水加至25 μl。反應體系在冰上配制，混勻，瞬時離心后置于PCR儀，95℃預變性5 min后;95℃變性30 s，56℃退火30 s，68℃延伸60 s，進行30 個循環;最后68℃延伸5 min。(2)PCR拼接獲得PRKAG2 R302Q全長。將上述純化得到的2個分段PCR產物RSa、RSb作為模板，采用F1/R1引物PCR擴增，得到PRKAG2 R302Q基因片段，PCR擴增產物全部上樣，用1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下切割目的片段，膠回收試劑盒純化。PCR體系及反應條件:模板RSa 0.5 μl，模板 RSb 0.5 μl，F1 0.5 μl，R1 0.5 μl，KOD DNA 聚合酶1 μl，濃度 2 mmol/L 的 dNTP 4 μl，濃度25 mmol/L 的 MgSO42 μl，10 × KOD Buffer 5 μl，無菌雙蒸水加至50 μl。反應體系在冰上配制，混勻，瞬時離心后置于PCR儀，95℃預變性5 min后;95℃變性30 s，56℃退火30 s，68℃延伸2 min，進行30 個循環;最后68℃延伸5 min。

1.2.4 重組載體 pR302Q-IRES2-EGFP的構建(1)酶切、連接、轉化。用Nhe I、BamH I雙酶切回收產物R302Q片段和pIRES2-EGFP載體，37℃水浴酶切2 h。酶切體系:10 × TangoTMBuffer 5 μl，Nhe I 2 μl，BamH I 2 μl，R302Q/pIRES2-EGFP 25 μl，無菌雙蒸水加至50 μl。PCR清潔試劑盒回收酶切基因及載體產物，T4DNA連接酶4℃連接過夜，得到的質粒為pR302Q-IRES2-EGFP。將重組質粒42℃熱擊轉化Top10感受態細胞，37℃培養箱中培養過夜。(2)陽性克隆鑒定。挑取轉化板的單克隆，置于20 μl無菌水中溶解，取1 μl菌液作模板，特異引物F1/R1進行PCR擴增，取5 μl擴增產物，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。反應體系:10×Taq Buffer 2 μl，F1 0.3 μl，R1 0.3 μl，菌液 0.5 μl，Taq 0.3 μl，濃度 2 mmol/L 的 dNTP 2 μl，無菌雙蒸水加至 20 μl。反應體系在冰上配制，混勻，瞬時離心后置于PCR儀，94℃預變性5 min后;94℃變性30 s，61℃退火30 s，72℃延伸2 min，進行30個循環;最后72℃延伸10 min。挑取PCR鑒定正確的陽性克隆進一步采用Nhe I、BamH I雙酶切驗證后，挑取2個克隆送Invitrogen公司采用通用引物測序。Axygen質粒小抽試劑盒抽提測序正確的克隆質粒。

2 結果

2.1 人野生型PRKAG2基因的克隆

Trizol法提取人細胞mRNA，經RT-PCR合成cDNA第1條鏈，特異性引物PCR擴增得到PRKAG2基因片段，目的片段條帶在1710 bp左右，酶切連接至pIRES2-EGFP載體中測序驗證，與NCBI公布序列完全一致，表明正確擴增出PRKAG2基因片段見圖1。

圖1 人野生型PRKAG2的RT-PCR電泳圖

2.2 人突變型基因PRKAG2R302Q的克隆

以人野生型基因PRKAG2為模板，通過PCR拼接的方法，分段擴增得到PRKAG2R302Q基因2段，大小分別為900 bp與800 bp左右，均與預期一致。見圖2。膠回收純化克隆得到的基因片段，再分別以以上2個片段為模板，通過PCR拼接得到了約1700 bp的目標片段，與預期一致。見圖3。

圖2 PRKAG2的RSa、RSb片段擴增結果

2.3 重組載體pR302Q-IRES2-EGFP的構建

以Nhe I、BamH I分別雙酶切 pIRES2-EGFP和上述膠回收片段，1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下切割陽性片段，膠回收試劑盒回收酶切片段。經T4DNA連接酶連接雙酶切產物，構建pR302Q-IRES2-EGFP重組載體。轉化Top10感受態細胞，菌落PCR篩選陽性克隆。見圖4。篩選得到的陽性克隆進一步采用酶切驗證。見圖5。挑取2個陽性克隆送Invitrogen公司測序，結果與設計完全一致。

圖3 PRKAG2 R302Q的RSa、RSb片段拼接電泳圖

圖4 pR302Q-IRES2-EGFP重組載體菌落PCR鑒定結果

圖5 pR302Q-IRES2-EGFP重組載體酶切鑒定結果

3 討論

PRKAG2是AMPK γ2調節亞基的編碼基因，在心肌和骨骼肌高度表達［5］。AMPK是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，由α、β、γ亞基組成異質三聯體，在細胞中作為代謝感受器，監測細胞內AMP/ATP比值，通過調節ATP的消耗和產生，在心肌代謝過程中發揮關鍵作用。在低氧、缺血、肌肉運動等應激情況下，細胞內AMP/ATP的比值升高，AMP與AMPK的γ亞基結合，使α亞基的蘇氨酸暴露，通過上游激酶-AMP激活蛋白激酶激酶(AMP-activated protein kinase kinase，AMPKK)使蘇氨酸磷酸化，AMPK 被激活［6］。AMPK激活后通過減少維持生命并非必要的ATP消耗，以及通過促進細胞內葡萄糖的攝取和加強氧化分解代謝刺激ATP的產生，調節體內代謝平衡［7］。

關于PRKAG2突變對AMPK功能的影響，在細胞水平的研究發現，轉染突變型PPKAG2基因的人CCL13 細胞株的 AMPK 活性降低［8］;而 Arad 等［9］的研究表明，AMPK基礎活性反而增高。Hamilton［10］和Barnes［11］等的研究結果與Arad的研究結果一致，并且發現AMPK對AMP的敏感性降低。Burwinkel等［12］認為，由于不同實驗所用的細胞株不一樣，因此研究結果不同。CCL13細胞株中的腫瘤抑制蛋白LKB1是AMPK的主要上游底物，含量與其他細胞有顯著差異，而突變的AMPK結構基因只有在足量LKB1存在的條件下才能增加AMPK的基礎活性，并降低AMPK對AMP的敏感性。

研究表明，PRKAG2心臟綜合征患者均有PRKAG2基因突變。所以，對該基因突變進行研究，進而闡述其發病機制尤為重要。為闡明這種缺陷機制，Sidhu等制備了表達人類突變PRKAG2基因的轉基因小鼠［13］，轉基因小鼠出現的變化表型與人的家系性預激患者相似。

本研究克隆了突變型人PRKAG2 R302Q基因并構建了其真核表達載體pR302QvIRES-EGFP，后續可通過轉染心肌細胞進行相關檢測，為進一步研究PRKAG2 R302Q突變功能奠定了基礎。

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