小腸粘膜下層細胞相容性的研究進展

張承旻

（遵義醫學院附屬醫院 貴州 遵義 563099）

1 背景

小腸粘膜下層（small intestinal submucosa，SIS）是將小腸去除漿膜層、肌層及黏膜層，以及一系列加工和消毒處理后，獲得的一種不含細胞的細胞外基質。是一種理想的組織工程學材料。其在組織修復方面具有3方面的生物學優勢。1、組織相容性：SIS主要由Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白構成，并含有豐富的纖維連接蛋白［1］及生長因子，即使經過一系列加工處理后SIS仍還有這些生長因子［2、3］。如成纖維細胞生長因子－2、轉移生長因子－β、血管內皮生長因子、血小板源性生長因子等。這些物質均為正常細胞外基質的成分。其中Ⅰ型膠原蛋白及纖維連接蛋白均可于細胞膜特異性結合，并激活細胞傳導通路促進細胞的粘附［4］；而各種生長因子也可以刺激細胞增殖。SIS不僅能為宿主細胞提供附著和遷移的自然環境，還能很快與宿主組織結合，促進血管生成，恢復組織功能。2、免疫原性和安全性：經過機械法和化學法聯合處理的SIS不含細胞，其攜帶病原體的概率很低，而且其免疫原性弱，即使異種移植后亦不產生排斥反應［5］。SIS經消毒處理后，所含有的各種組分不會丟失或失活，超微結構及機械特性無明顯改變。因此，經消毒處理后SIS具有較高的安全性。同時Sarikaya A等［6］指出SIS浸出液對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有抑制作用，可以抑制細菌的生長。3、生物力學性能：小腸黏膜下層是一種非線性材料，在縱軸方向（無論是否刨開管壁）的抗拉伸強度相當于肌腱和韌帶組織的1／7到1／4［7］。SIS作為體內組織工程的材料，具有適當的機械特性，能承受周圍組織壓力，為再生細胞提供足夠的生長空間。

SIS因為其良好的生物學優勢，已被廣泛應用于基礎研究及臨床替代材料。Bejjani GK等［8］用SIS作為硬脊膜替代材料治療了59例臨床病人，其中包括Chiari畸形、腦部腫瘤患者術中需要修補硬脊膜者，術后隨訪僅1例并發腦脊液漏，2例并發感染。其余患者均恢復良好。SIS還被用于疝、肛瘺的修復，以及作為皮膚替代材料等。

作為組織工程學支架材料首先必須具備細胞相容性，由于研制的組織工程化組織最終的目的是要移植入生物體，因此必須能與生物系統相結合。支架材料的細胞相容性包括細胞在材料中的粘附、擴展、遷移、生長及功能特性。目前對SIS細胞相容性的研究非常多。

2 SIS與細胞相容性研究進展

2.1 SIS與骨髓基質干細胞（BMSC）相容性：張開剛等［9］用SIS與BMSC體外構建組織工程骨膜。在體外聯合培養過程中用相差顯微鏡、掃描電鏡及透射電鏡觀察，認為SIS本身所含有的活性生長因子可促進兔BMSC的分化、增殖。細胞培養7天后附著材料表面數量明顯增多，10天后細胞連成一片，2周時細胞數量更多，細胞層數也更多。通過透射電鏡觀察，BMSC在SIS上細胞核成梭型或不規則型，內質網豐富、擴張，細胞基質致密。說明在SIS上的BMSC細胞活力強，但隨著時間延長，底層細胞活力比上層減弱。王軍勝等［10］通過用不同方法預濕SIS，證明胎牛血清預濕的SIS可以使兔BMSC較早的伸展完全粘附于SIS支架上。他們認為胎牛血清可以保護細胞、促進細胞粘附及增殖。

2.2 SIS與前脂肪細胞相容性：蘭海等［11］取人脂肪組織消化后與SIS聯合培養。通過MTT法檢測。對照組細胞接種1天后進入快速增殖期，而材料組經過3天潛伏期后快速增殖，兩組增殖速度接近，材料組比對照組晚6天進入平臺期。認為SIS含有的細胞外基質成分促進人前脂肪細胞增殖，而且其空間結構也有利于細胞生長及粘附。

2.3 SIS與schwann細胞相容性：蘇琰等［12］在體外復合培養SCs與SIS，通過組織學方法檢測SCs在SIS支架上生長的情況，并通過SCs分泌神經生長因子（NGF2β）和腦源性神經營養因子（BDNF）量的多少來檢測SCs的細胞活性。通過相差顯微鏡和掃描電鏡觀察，可見SCs在SIS表面能夠良好地黏附，生長活躍，增殖旺盛；通過ELISA檢測發現SCs與SIS復合培養后，其分泌NGF2β與BDNF的神經營養因子功能良好，與正常培養的SCs無顯著性差異。通過這兩方面的檢測證明SCs與SIS相容性良好。盧洪凱等［13］將SCs與SIS體外復合培養后移植到CN神經損傷大鼠模型神經損傷處，術后3個月行阿樸嗎啡試驗及檢測大鼠海綿體內nNOS表達，證明SCs與SIS復合移植物可以修復CN損傷。傅一山等［14］將SCs與SIS復合培養后移植修復大鼠損傷脊髓，術后4－12周進行形態學檢查發現移植處炎性細胞浸潤不明顯，有大量再生的有髓神經軸突，無明顯變性壞死和膠質瘢痕增生現象。

2.4 SIS與成骨細胞相容性：羅靜聰等［15］利用人胚骨膜成骨細胞（HEPOB）與SIS體外培養，通過形態學檢測，HEPOB24小時后在SIS周邊粘附，隨著時間延長細胞數量增多，融合成片，細胞計數均在5天時達最高值，而復合培養細胞計數5天時較3天時計數加倍率高于單純培養組，說明SIS可促進HEPOB的增殖。

2.5 SIS與上皮細胞相容性：Gabouev AL等［16］在SIS上種植膀胱上皮細胞和膀胱平滑肌細胞，免疫組織化學染色顯示，在SIS上形成了膀胱上皮細胞和膀胱平滑肌細胞雙層結構，說明利用SIS可以成功地制成組織工程化的膀胱壁。Lindberg K等［17］將上皮細胞種植在SIS上，第2天上皮細胞即出現2～3層上皮樣結構，10余日后SIS表面下出現小的成簇的上皮細胞，顯現出分層的鱗狀上皮樣結構，組織學觀察可見基本成熟的上皮結構，而且上皮細胞表現出優先遷入SIS的管狀結構。譚波等［18］采用混合酶消化法，于6%胎牛血清的上皮細胞無血清培養基中培養犬空腔粘膜上皮細胞（OMECs），將第2代犬OMECs接種在SIS上，行蘇木精－伊紅染色、免疫組織化學染色、掃描電鏡等觀察OMECs在SIS上的生長狀況。OMECs接種在SIS上呈單層生長，多角形，鋪路石樣排列，復合培養8天后呈多層生長。

2.6 SIS與胰島細胞相容性：Woods EJ等［19］將純化的胰島細胞種植在SIS上，并給予糖刺激，根據放射免疫法檢測顯示，第2周末胰島細胞表現出高胰島素分泌，第3周末胰島細胞與對照組相比，形態正常，胰島素分泌量增加。用SIS作為支架材料對胰島細胞進行移植，能夠加強胰島細胞在體外的功能和活性，是臨床治療糖尿病的新方法。

2.7 其它：楊志明等［15］體外培養人胚皮膚成纖維細胞（HESFB）與兔腎血管內皮細胞（RRVEC），并在體外與SIS復合培養。通過MTT法測定細胞增殖，用流式細胞儀檢測復合培養細胞在不同培養時間的細胞周期、細胞凋亡。等到SIS對兩種細胞的細胞周期及細胞凋亡均無影響。SIS與HESFB、RRVEC有良好的相容性。

3 結語

因為小腸粘膜下層本身為細胞外基質，經過處理后無免疫原性及毒性，但是含有許多有利于細胞粘附及生長的細胞因子，是一種理想的天然可降解組織工程學支架材料。現在SIS已經在基礎及臨床方面進行了大量研究，SIS在基礎實驗中與多種細胞在體外復合培養均顯示SIS有良好的細胞相容性。但是現在主要是應用SIS本身所含有的細胞因子來促進細胞在SIS上粘附、增殖，只有個別學者［10］對SIS進行預處理后再與細胞復合培養。目前沒有一種理想的預處理方式可以使細胞在SIS上更好的粘附、增殖，也沒有文獻報道過SIS上粘附細胞的具體數量。所以對于SIS的細胞相容性還需更多的關注及研究。

［1］張開剛，曾炳芳，張長青.骨髓基質干細胞復合小腸黏膜下層體外構建組織工程骨膜的實驗研究［J］.中華外科雜志，2005.12：1594－1597

［2］王軍勝，王栓科，高恩建，等.不同預濕方法對構建組織工程骨膜細胞黏附率的影響［J］.中國組織工程研究與臨床康復.2008.04.08：2806－2810

［3］蘭海，黃富國，楊志明，等.前脂肪細胞在小腸黏膜下層的生長與增殖［J］.中國組織工程研究與臨床康復.2010.06.18：4599－4602