運用組織工程技術修復眼表損害的研究進展

張毓敏

(武警北京總隊三師第二支隊衛生隊100081)

正常的眼表是由結膜和角膜上皮組成的，這兩種上皮具有不同的細胞表型。其中，完整的角膜上皮對維持角膜的屏障功能，屈光功能及透明性起著關鍵作用。角膜上皮是一種能夠不斷自我更新的組織，其完整性的維持依賴于角膜緣干細胞的不斷增殖［1］。同時，角膜緣作為一種屏障可阻止結膜血管侵入，對角膜透明狀態及其正常視功能的維持具有重要意義。當角膜的完整性遭到化學傷及熱燒傷、輻射損傷、微生物感染等因素的破壞以致角膜緣干細胞嚴重缺乏或功能障礙時，會出現角膜的"結膜化":結膜上皮增生移行、角膜上皮持續缺損、基質瘢痕、新生血管形成、杯狀細胞出現，對患者視力造成嚴重的威脅。為了挽救上述嚴重的眼表損害，研究者已經嘗試多種方法進行眼表重建。

1.眼表損害既往治療方法

(1)自體組織移植:①結膜移植術:通過自體結膜移植修復單側眼化學傷;②角膜緣移植術:采用自體的角膜緣組織進行移植，取得很好的療效。但由于自體組織取材量有限，故僅適用于單眼或雙眼局限性角膜緣受損的病例。而且健康組織缺損引起的損害亦不能忽視，所以這并不是最佳的治療方法。

(2)同種異體組織移植:由于異體角膜緣移植術存在排斥反應而限制了其運用。此外，角膜緣移植的成功率還取決于角膜基質的微環境。雖然這一療法克服了自體組織移植的供量有限等缺點，但由于移植后的免疫排斥反應尚不能完全克服，需長期使用免疫抑制劑，再加上供體來源的限制，以及醫學倫理學方面的障礙，至今尚未能廣泛用于臨床。

2.組織工程學在眼科學的應用及進展:運用組織工程技術制備工程化角膜上皮為眼表損害的治療帶來了新的思路。將活細胞與可降解支架材料結合，在體外構建有生命的種植體，植入體內修復組織缺損，重建功能，以達到治療疾病目的的一門新興學科［3－4］。

(1)組織工程角膜上皮

1)通過體外培養擴增的方法獲得足夠量的種子細胞，種植于一種生物相容性良好的載體上復合成組織工程化角膜上皮，移植到患者眼表治療眼表損害。理想的種子細胞應有較強的增殖能力且能長期保持其特有的生物特性。目前主要有三個來源:角膜緣干細胞、胚胎干細胞和非眼表來源的上皮細胞。除了理想的種子細胞外，合適的支架材料也是組織工程化角膜上皮構建成功的關鍵。材料必須滿足以下幾點:①自身及其降解產物對機體無毒性;②具有優良的生物相容性和組織相容性;③不引起排斥反應和炎性反應;④在機體內可逐漸降解吸收，降解和吸收的速度與組織細胞的生長繁殖速度相匹配。目前用于組織工程化角膜上皮的支架材料主要分成天然載體和人工合成載體兩類。天然載體包括羊膜，角膜基質，膠原等。人工合成載體包括聚乳酸(PLA)和聚羥基乙酸(PGA)、纖維蛋白等。

隨著對羊膜基礎研究的深入和顯微手術技術的提高，羊膜廣泛應用于臨床眼表重建中。研究表明，羊膜在移植術后通過一些生長因子如:皮生長因子(EGF)，角化細胞生長因子(KGF)，肝細胞生長因子(HGF)，堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)等促進上皮增生分化。

羊膜具有抑制血管內皮細胞的遷徙和生長的作用，從而抑制了角膜新生血管的發生。此外，羊膜材料易獲得，免疫原性低，具有抗微生物的特性和較強的抗粘附性，還可作為理想細胞載體。正是因為上述優點，羊膜已用于多種眼表疾患的治療和重建術中角膜上皮的缺損。近年來將角膜緣干細胞等種子細胞培養在羊膜上構建羊膜角膜植片用于治療角膜緣干細胞缺失已有成功的報道并成為目前研究的熱點。

2)種子細胞構建組織工程化角膜上皮一個必要條件是理想的種子細胞。隨著對角膜緣干細胞研究的不斷深入，以角膜緣干細胞為種子細胞構建組織工程化角膜上皮的技術已經比較成熟［2］。1997年，Pellegrini等［3］首次應用角膜緣干細胞體外培養構建角膜上皮組織對2例堿燒傷患者施行自體移植，隨訪2年，重建的角膜維持穩定、透明，組織無血管化。Schwab［4］將自體角膜緣干細胞體外培養擴增后，種植于羊膜上構建角膜上皮，回植治療19例嚴重眼表皮損傷患者，效果良好。以LSCs作為種子細胞聯合適宜載體的移植術，在很大程度上解決了角膜移植材料不足的問題，而且大大降低了移植排斥反應的發生，是治療干細胞缺乏的眼表疾病最有吸引力的方法之一。但是，這一治療手段不適用于那些雙眼嚴重受損，不存自體角膜緣移植來源的患者［5］。因此，許多研究者開始嘗試其他來源的細胞。這些細胞包括胚胎干細胞、口腔上皮細胞、骨髓干細胞等［3］。

胚胎干細胞(ESC)來源于早期胚胎的多能干細胞，是一種體外培養時能維持正常核型，在一定條件下能誘導分化成各系統細胞的高度未分化細胞。ESC系確立，為許多組織器官的移植提供了可能，選取適宜載體利用胚胎干細胞作為種子細胞誘導分化為角膜緣干細胞或角膜上皮細胞已實現了實驗性的眼表重建。

口腔粘膜上皮細胞作為種子細胞治療眼表疾病已成為研究熱點。Nakamura等［6］將取自兔的口腔粘膜上皮細胞以羊膜為載體，進行體外培養2～3周，組織學檢查發現經培養的兔口腔粘膜上皮細胞復合物有4～5層的復層上皮細胞、分化良好，外觀上與正常角膜上皮細胞相似。免疫組化分析顯示培養的口腔上皮細胞表達角膜特異性的角蛋白，具有非角化上皮的特征。電鏡觀察顯示以羊膜為載體培養的口腔上皮細胞具有與角膜上皮細胞相似的半橋粒，橋粒等對維持角膜上皮正常功能非常重要的特異性連接結構。故采用體外培養口腔粘膜上皮細胞作為種子細胞來重建眼表，是治療嚴重眼表疾病的新途徑之一。

(2)應用:自體來源細胞構建組織工程化角膜上皮可以避免異體移植的免疫反應;且由于細胞經體外擴增，因而取材量較小，對同側眼的健側象限或對側健眼不會造成較大的損傷。1997年，Pellegrini等［7］首次應用角膜緣干細胞體外培養構建角膜上皮組織對堿燒傷患者施行自體移植，隨訪2年，重建的角膜維持穩定、透明，無血管化。隨后，Schwab［8］報道了將自體角膜緣干細胞體外培養擴增后，種植于羊膜上構建角膜上皮，回植治療19例嚴重眼表損害患者，效果良好。Tsai等［9］以羊膜為載體構建組織工程化角膜上皮移植片進行眼表重建也獲得成功。Nishida等［10］將自體口腔粘膜上皮細胞體外培養移植重建眼表，發現術后一周所有患者角膜熒光素染色陰性、角膜恢復透明。在隨訪期14個月內，角膜上皮保持穩定并透明。

(3)可行性:以上皮細胞作為種子細胞治療眼表疾病已成為研究熱點。與表皮角質化細胞相比，自體上皮細胞處于較低的分化階段，體外培養時間較短，能夠較長時間維持非角化狀態。此外，角蛋白K3是角膜分化形態的可靠標志物，而研究發現體外培養正常上皮細胞也表達該蛋白。免疫組化分析顯示培養的上皮細胞移植片表達角膜特異性的角蛋白K3，具有非角化上皮的特征。超微結構方面，電鏡觀察顯示以羊膜為載體培養的上皮細胞具有與角膜上皮細胞相似的半橋粒，橋粒等對維持角膜上皮正常功能非常重要的特異性連接結構。以上特征說明了體外構建組織工程角膜上皮移植片為角膜上皮理想替代物用于眼表重建的可行性。

3.問題與展望:組織工程技術的發展，為治療嚴重眼表損害提供了新的思路。對各種眼表損害來說，運用羊膜構建角膜上皮移植片修復眼表是一種新的可行的治療方法。相比于異體角膜移植來說，避免了術后長期應用免疫制劑所產生的并發癥。然而，上皮細胞組織工程化角膜的研究尚處于起步階段。在雙眼干細胞缺失的情況下，用自體上皮細胞進行眼表重建短期效果理想，但上皮細胞屬于成體細胞，終究會凋亡。這就對應用上皮細胞進行眼表重建的長期效果和可行性提出了挑戰。此外，上皮細胞在載體上的固定、細胞的鑒定，以及影響上皮細胞體外培養分裂，增殖的因素等問題仍需要進一步研究以明確。但相信隨著各項工作的不斷深入，這些問題都會得到解決。

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6 Nakamura T，Kinoshita S.Ocular surface reconstruction using cultivated mucosal epithelial stem cells［J］.Cornea，2003，22(7):75－80.

7 Pellegrini G，Traverso CE，Franzi AT，et al.Long－term restoration of damaged corneal surfaces with autologous cultivated corneal epithelium［J］.Lancet，1997，349(9057):990－993.

8 Schwab IR，Reyes M，Isseroff RR.Successful transplantation of bioengineered tissue replacements in patients with ocular surface disease［J］.Cornea，2000，19(4):421－426.

9 Tsai RJ，Li LM，Chen JK.Reconstruction of damaged corneas by transplantation of autologous limbal epithelial cells［J］.N Engl JMed，2000，343(2):86－93.

10 Nishida K，Yamato M，Hayashida Y，et al.Corneal reconstruction with tissue－engineered cell sheets composed of autologous oralmucosal epithelium［J］.N Engl JMed，2004，351(12):1187－1196.