氯胺酮對重癥急性胰腺炎肺損傷大鼠NF-κB的影響

姜金玉 鄭賢軍 孔高茵 張 宇

（湖南省人民醫院麻醉科，湖南 長沙 410005）

氯胺酮對重癥急性胰腺炎肺損傷大鼠NF-κB的影響

姜金玉 鄭賢軍 孔高茵 張 宇

（湖南省人民醫院麻醉科，湖南 長沙 410005）

目的 探討氯胺酮對重癥急性胰腺炎肺損傷大鼠NF-κB的影響。方法 60只健康雄性SD大鼠，隨機分為對照組，SAP組和氯胺酮干預組（KTM組），每組20只。應用逆行胰膽管泵注5%牛磺膽酸鈉誘導大鼠重癥急性胰腺炎。氯胺酮干預組術后腹腔給予4mg/kg氯胺酮。造模后12h檢測肺濕重干重比，肺泡灌洗液中蛋白含量和中性粒細胞百分比，并應用原位雜交法檢測造模后6h，12h肺組織NF-κB p65mRNA的表達。結果 NF-κB p65mRNA在SAP時除肺泡的細胞質內有表達外，出現細胞核內表達，隨時間的延長表達逐漸增加，KTM組NF -κB p65mRNA的表達明顯下降。結論 NF-κB活化與SAP的肺損傷密切相關，氯胺酮可以通過抑制NF -κB p65mRNA的表達起到肺保護作用。

胰腺炎；核因子-κB；氯胺酮

急性肺損傷（ALI）甚至急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）是重癥急性胰腺炎（（Severe acute pancreatitis，SAP）常見并發癥，尤其是繼發感染時，ALI/ARDS具有相當高的病死率[1,2]。潛在的機制是復雜的，知之甚少。目前認為SAP實際上是一種嚴重的全身炎癥反應綜合征（SIRS），炎性介質的失控性釋放是造成SIRS的主要原因[3]。本實驗探討NF-κB在急性重癥胰腺炎肺損傷發病中的作用及氯胺酮對其的干預效用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

牛磺膽酸鈉購自Sigma公司，NF-κBp65mRNA 原位雜交試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司，氯胺酮由江蘇恒瑞醫藥股份有限公司提供，SD大鼠由湖南省人民醫院實驗動物中心提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組

健康成年（10～12周齡）雄性SD大鼠60只，體質量180～250g。所有SD大鼠按隨機數字表分為3組，A組：對照組；B組：SAP組；C組：氯胺酮干預組，每組20只。

1.2.2 SAP模型制備

術前所有SD大鼠術前禁食12h，自由飲水。麻醉采用10%水合氯醛3mL/kg腹腔注射。麻醉后仰臥位固定，術野備皮，消毒鋪單。模型組上腹部正中切口，暴露十二指腸、胰膽管和膽總管，用小動脈夾夾閉靠近肝門的胰膽管，在手術顯微鏡下，將直徑大約0.45mm的聚乙烯導管緊貼胰膽管匯入十二指腸處置人胰膽管，再用小動脈夾將遠端也夾閉。用GRASBY 3500微量注射泵逆行泵入5%牛磺膽酸鈉（1mL/kg，0.04mL/min），泵注完畢2～3min后即可見胰腺充血、水腫，胰膽管及主胰管擴張， 泵注完畢后保持壓力10min后拆線，并退出導管，創面封閉膠封閉穿刺孔，撤除小動脈夾，將腸管還納復位后關腹[4]。對照組為假手術組，開腹僅翻動胰腺后關腹。

1.2.3 氯胺酮干預實驗

氯胺酮干預組術畢腹腔內注射氯胺酮4mg/kg（生理鹽水稀釋成1mL），對照組與SAP組手術后腹腔內注射生理鹽水1mL。

1.2.4 肺濕干重比

每組10只于造膜12h后實驗結束，放血處死，開胸取左肺組織稱濕重（W）后將標本置于80℃電熱干燥箱內烘烤48h，然后稱干重（D），肺濕干重比=W/D。

1.2.5 肺泡灌洗液（BALF）中中性粒細胞百分比與蛋白含量

處死動物前，夾閉左主支氣管，經右支氣管肺泡灌洗，回收率為90%，將肺泡灌洗液3000r/min離心10min，取上清液進行蛋白定量測定。取沉淀物用Giemsa染色后光學顯微鏡下計數白細胞和中性粒細胞，計算中性粒細胞百分比。

1.2.6 肺組織NF-κB p65Mrna

每組余下的10只SD大鼠中5只于術畢6h，另5只于術畢12h取右肺上葉組織用4%多聚甲醛、0.1%DEPC固定液固定，常規脫水、透明、浸蠟、包埋、石蠟切片。應用NF-κBp65mRNA原位雜交試劑盒檢測。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 大鼠肺W/D、BALF中蛋白含量和中性粒細胞百分比的變化

對照組大鼠肺W/D為（4.52±0.28）；SAP組（6.42±0.25）與KTM組（5.58±0.19）的差異有統計學意義（P＜0.01）。SAP組大鼠BALF中蛋白含量和中性粒細胞百分比對照組明顯升高（P＜0.01），KTM組與SAP組對比，BALF中蛋白含量和中性粒細胞百分比明顯下降（P＜0.01），見表1。

表1 各組肺W/D、BALF蛋白含量和中性粒百分比的變化（）

表1 各組肺W/D、BALF蛋白含量和中性粒百分比的變化（）

與對照組相比，★P＜0.01；與SAP組相比，$P＜0.01

BALF中性粒百分比（%）對照組4.52±0.280.15±0.02822.56±8.45 SAP組6.42±0.25★0.68±0.045★78.85±9.680★KTM組5.58±0.19★$0.48±0.075★$56.72±10.63★$組別肺W/DBALF蛋白含量（ g/L）

2.2 肺組織中NF-κBp65mRNA的表達

NF-κBp65mRNA在對照組部分肺泡細胞細胞質內有表達，而在細胞核內未見表達。SAP組除肺泡細胞細胞質內有表達外，出現細胞核內表達。用圖象分析儀測量細胞胞漿內陽性反應物的平均吸光度值（A），SAP組與對照組相比有顯著性差異，（P＜0.01），KTM組與SAP組比較，NF-κBp65mRNA的表達明顯降低（P＜0.01） （表2）。

表2 NF-κB p65mRNA在各組大鼠肺組織中的表達

3 結 論

已證實核轉錄因子-kappaB （NF-κB）在細胞內調控多種炎癥介質轉錄過程中發揮了關鍵作用，并參與了SAP炎性介質的調控[5]。NF-κB通常以由NF-κB/Rel家族組成的同源或異源復合物形式存在，其中最常見的為p65/p50異二聚體，也是其活性的主要形式[6]。Kan[7]等研究發現NF-κB的激活可能是通過調節iNOS mRNA表達參與SAP肺損傷。Jaffray[8]等研究發現胰彈性蛋白酶誘導的細胞因子介導的肺損傷，這種途徑是以NF-κB作為第二信使發揮作用。NF-κB的激活可促進多種炎性遞質在SAP時過度表達，引起胰腺和胰外組織器官損傷。最近的數據表明氯胺酮有抗炎[9]作用。然而，氯胺酮誘導的免疫調節[10]機制則知之甚少。在這項研究中，我們采用牛磺膽酸鈉制作大鼠急性壞死性胰腺炎模型，重點觀察氯胺酮在肺損傷發生時對NF -κB的影響。研究氯胺酮的免疫調節作用是否與NF-κB有關。研究結果表明：SAP組大鼠BALF中蛋白含量和中性粒細胞百分比對照組明顯升高，NF-κBp65mRNA在肺組織中的表達也明顯增加，其表達亦隨造模時間的延長而增強。說明SAP肺損傷與NF-κB的激活有關。KTM組與SAP組對比，肺濕干重百分比、肺泡灌洗液中蛋白含量和中性粒百分比均降低，可能是通過下調NF-κB p65mRNA的表達，減少炎癥介質的產生有關。

總之，在這項研究中轉錄因子NF-κB表達的抑制可以解釋一些與氯胺酮治療相關的免疫抑制作用，如減少吞噬細胞表面受體和降低炎性細胞因子的生成等。但氯胺酮抑制NF-κB的信號途徑需進一步闡明。此外，對于其他轉錄因子的影響還有待研究。

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[4] 王鋒,黃鶴光,陸逢春,等.膽胰管結扎法制作大鼠胰源性肺損傷模型[J].中國普外基礎與臨床雜志,2012,19(1):26-30.

[5] 裴紅紅,楊正安,秦兆寅.核因子-κB與急性胰腺炎[J].中國危重病急救醫學,2001,13(4):248-249.

[6] Ghosh S,May MJ,Kopp EB.NF-kappa B and Rel proteins:evolutionarily Conserved mediators of immune responses[J].Annu Rev Immunol,1998,16(2):225-260.

[7] Kan SH,Huang F,Tang J,et al.Role of intrapulmonary expression of inducible nitric oxide synthase gene and nuclear factor kappaB activation in severe pancreatitis-associated lung injury[J].Inflamm ation,2010,33(5):287-294.

[8] Jaffray C,Yang J,Carter G,et al.Pancreatic elastase activates pulmonary nuclear factor kappa B,mimicking pancreatitis-associated adult respiratory distress syndrome[J].Surgery,2000,128(2):225-231.

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R576

B

1671-8194（2013）24-0069-02