鼻通貼細(xì)胞毒性測(cè)定方法的確定

宋 陽(yáng)* 宋廣群

（1 武警上海總隊(duì)醫(yī)院藥劑科，上海 201103；2 武警黑龍江總隊(duì)醫(yī)院藥劑科，黑龍江 哈爾濱150010）

鼻通貼細(xì)胞毒性測(cè)定方法的確定

宋 陽(yáng)1* 宋廣群2

（1 武警上海總隊(duì)醫(yī)院藥劑科，上海 201103；2 武警黑龍江總隊(duì)醫(yī)院藥劑科，黑龍江 哈爾濱150010）

目的 定鼻通貼細(xì)胞毒性的測(cè)定方法。方法 采用小鼠成纖維細(xì)胞ATCC（L929），比較分別采用MTT法和瓊脂覆蓋法對(duì)鼻通貼進(jìn)行細(xì)胞毒性試測(cè)定的結(jié)果。結(jié)果 MTT法檢測(cè)細(xì)胞毒性方法簡(jiǎn)便、快速，結(jié)果 比較穩(wěn)定可靠，能進(jìn)一步量化。結(jié)論 MTT試驗(yàn)方法更適合鼻通貼的細(xì)胞毒性測(cè)定。

鼻通貼；細(xì)胞毒性；浸提液

鼻通貼是治療鼻炎的材料，屬于醫(yī)療器械的范疇。根據(jù)GB/ T16886.2003/ISO10993-5 醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)的試驗(yàn)原則，本文通過(guò)MTT法和瓊脂覆蓋法兩種方法，對(duì)鼻通貼細(xì)胞毒試進(jìn)行研究，結(jié)果如下。

1 材 料

1.1 樣品及對(duì)照材料[1]

1.1.1 樣品

鼻通貼，規(guī)格：7.5cm×1.8cm，批號(hào)： 20100408，由哈爾濱市天地仁醫(yī)藥科技有限公司提供，同一批號(hào)至少取3個(gè)供試品。

1.1.2 陰性對(duì)照材料

經(jīng)確認(rèn)的不產(chǎn)生細(xì)胞毒性反應(yīng)的高密度聚乙烯。

1.1.3 陽(yáng)性對(duì)照材料

經(jīng)確認(rèn)的可重現(xiàn)細(xì)胞毒性反應(yīng)的含有有機(jī)錫添加劑的聚氯乙烯。（瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)陽(yáng)性對(duì)照液為20%苯酚溶液）。

1.2 細(xì)胞系

小鼠成纖維細(xì)胞ATCC（L 929），從建立的細(xì)胞系并已認(rèn)可的貯源中獲取。本試驗(yàn)使用的細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，使用的是無(wú)支原體污染細(xì)胞。

1.3 儀器與試劑

Sunrise酶標(biāo)儀、CO2孵箱。超凈工作臺(tái)、冰箱、倒置光學(xué)顯微鏡、光學(xué)顯微鏡、蒸汽滅菌器、液氮瓶、電熱恒溫水浴鍋、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、移液器，可調(diào)式微量加樣器。MEM培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基（美國(guó)GIBCO公司），胎牛血清（美國(guó)GIBCO公司），二甲基亞楓（Dimethyl Sulphoxide DMSO） （美國(guó)sigma公司）、消化液（0.25 %Trypsin & 0.02% EDTA（吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司）、磷酸鹽緩沖液（吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司）、（四唑鹽[ 3-（ 4，5-Dimethylthiazol-2-yl ） -2 ，5-diphenyltetr-azolium bro2mide ]）。

MTT溶液：MTT磷酸鹽溶液，濃度為5mg/ mL、中性紅磷酸鹽溶液，濃度為0.01% ，

2 方 法[2]

2.1 四唑鹽（MTT） 比色法

哺乳類動(dòng)物細(xì)胞的線粒體酶可將黃綠色的MTT 降解形成藍(lán)紫色，用二甲基亞砜（DMSO） 溶解后，用酶標(biāo)儀測(cè)定其濃度，從而定量測(cè)定細(xì)胞的存活比例。

2.1.1 樣品浸提液制備

浸提介質(zhì)為含10%新生牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基（空白對(duì)照液）。按照每毫升浸提液覆蓋6cm2 樣品進(jìn)行浸提。浸提條件為（37 ±2）℃浸提24h。采用相同條件制備陰性、陽(yáng)性對(duì)照材料浸提液。

2.1.2 試驗(yàn)步驟

①培養(yǎng)細(xì)胞達(dá)到其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末細(xì)胞趨于融合，用細(xì)胞消化液消化分散細(xì)胞，用細(xì)胞培養(yǎng)液配制成1 ×104個(gè)/ mL 的細(xì)胞懸液。取96孔培養(yǎng)板，每孔加入100μL的細(xì)胞懸浮液。輕輕水平轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)板使細(xì)胞均勻地分散在皿孔表面。②置于含5%二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)，（37± 2）℃下培養(yǎng)24h。③棄去原培養(yǎng)液，每孔加入100μL的空白對(duì)照液、陰性對(duì)照液、陽(yáng)性對(duì)照液、供試品浸提原液并以培養(yǎng)基作稀釋劑的i=1.5系列浸提稀釋液。每組至少設(shè)8孔。SI5置含5%二氧化碳培養(yǎng)箱，（37±2）℃下培養(yǎng)。培養(yǎng)間期為48h。⑤培養(yǎng)間期后，每孔加入PBS -Ca 100 μl 洗兩次，棄去孔內(nèi)液體，每孔分別加入MTT溶液20μL，置含5%二氧化碳培養(yǎng)箱，（37±2） ℃培養(yǎng)5h。⑥棄去孔內(nèi)液體，每孔分別加入150μl DMSO，將培養(yǎng)板放置振蕩儀上振蕩10min使孔內(nèi)溶液顏色均勻。⑦用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度，采用雙波長(zhǎng)測(cè)定法，選用的波長(zhǎng)為570nm，630nm。⑧結(jié)果計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增殖率RGR（%）=試驗(yàn)樣品組（陰性對(duì)照組，陽(yáng)性對(duì)照組）的吸光度／空白對(duì)照組的吸光度×100%。⑨結(jié)果判斷：根據(jù)RGR值，判定細(xì)胞毒性見(jiàn)表1。結(jié)果陰性對(duì)照組細(xì)胞毒性反應(yīng)為1級(jí)。陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞毒性反應(yīng)為3級(jí)。試驗(yàn)樣品組反應(yīng)見(jiàn)表2。

表1 細(xì)胞相對(duì)增殖率與細(xì)胞毒性分級(jí)的關(guān)系

表2 鼻通貼測(cè)量波長(zhǎng)與參考波長(zhǎng)吸收度差值的均值及細(xì)胞增殖率

2.2 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)

在細(xì)胞處于生理狀態(tài)時(shí)，用中性紅活體染色劑使細(xì)胞著色，但又對(duì)細(xì)胞無(wú)毒。用來(lái)研究觀察樣品對(duì)細(xì)胞形態(tài)和生理狀態(tài)影響。

2.2.1 樣品浸提液制備

浸提介質(zhì)為含10 %新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基（空白對(duì)照液）。浸提比例與MTT法相同。將濾紙剪成1.5cm×1.5cm小塊，用浸提介質(zhì)浸透?jìng)溆谩２捎门c試驗(yàn)樣品相同條件及方法制備的陰、陽(yáng)性對(duì)照材料浸提液。

2.2.2 試驗(yàn)步驟

①培養(yǎng)細(xì)胞達(dá)到其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末細(xì)胞趨于融合，用細(xì)胞消化液消化分散細(xì)胞，用細(xì)胞培養(yǎng)液配制成3×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液。制備平板細(xì)胞單層：每只培養(yǎng)皿加入10mL制備好細(xì)胞懸液，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿使細(xì)胞均勻的分布在培養(yǎng)皿底部。②放入含5%的二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h使其成為融合但不稠密的網(wǎng)狀的細(xì)胞單層。③棄去原培養(yǎng)液，將混合的MEM瓊脂培養(yǎng)基加入培養(yǎng)皿中10mL/皿放冷凝固后。④每個(gè)培養(yǎng)皿加入10mL新配制的0.01%中性紅活體染色液10mL，37℃避光染色15min；⑤棄去染色液每個(gè)皿放置3個(gè)試樣，放入含5%的二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h；⑥細(xì)胞反應(yīng)=褪色指數(shù)/溶解指數(shù)結(jié)果；⑦鏡下觀察結(jié)果評(píng)分，評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表3。細(xì)胞毒性反應(yīng)見(jiàn)表4。結(jié)果陰性對(duì)照組細(xì)胞毒性反應(yīng)為1級(jí)。陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞毒性反應(yīng)為4級(jí)。試驗(yàn)樣品組反應(yīng)見(jiàn)表5。

表3 瓊脂覆蓋法結(jié)果評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)及溶解指標(biāo)的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)

表4 細(xì)胞毒性反應(yīng)

表5 瓊脂覆蓋法測(cè)量鼻通貼細(xì)胞毒性反應(yīng)結(jié)果

3 討 論

細(xì)胞毒性試驗(yàn)可觀察生命細(xì)胞在外源性有害物質(zhì)的作用下所發(fā)生的一系列結(jié)構(gòu)與功能的改變，根據(jù)所采用的方法不同，可觀察到體外培養(yǎng)細(xì)胞受某種化合物刺激后細(xì)胞的凋亡、衰亡直至死亡的全過(guò)程。研究?jī)?nèi)容涉及外源性有害物質(zhì)對(duì)機(jī)體的細(xì)胞毒性作用、特異的細(xì)胞毒作用、細(xì)胞毒物代謝和毒物的細(xì)胞毒作用機(jī)理以及致癌性等，范圍十分廣泛，研究方法也各不相同。細(xì)胞毒性試驗(yàn)有很多種方法GB/16886.5-2003規(guī)定方法有直接接觸試驗(yàn)（MTT 法）、間接接觸試驗(yàn)（瓊脂覆蓋法）本次試驗(yàn)?zāi)康氖且云趶沫傊采w法、MTT法中篩選出適合本樣品細(xì)胞毒性的方法，建立一套簡(jiǎn)便、快速的體外細(xì)胞毒性檢測(cè)方法。通過(guò)試驗(yàn)兩種方法的細(xì)胞毒性測(cè)定結(jié)果基本吻合，但是瓊脂覆蓋法操作過(guò)程較MTT法復(fù)雜。并且結(jié)果判斷人為因素大，不能定量，而MTT法法的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便、快速、所需細(xì)胞數(shù)較少，試驗(yàn)周期短。其原理是根據(jù)哺乳類動(dòng)物細(xì)胞的線粒體酶可將黃綠色的MTT降解形成藍(lán)紫色，用二甲基亞砜（DMSO） 溶解后，用酶標(biāo)儀測(cè)定其濃度，從而定量測(cè)定細(xì)胞的存活比例。所以四唑鹽（MTT） 可用于鼻通貼的細(xì)胞毒性的測(cè)定方法簡(jiǎn)單可靠。

[1] GB/ T16886.12 - 2000.醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)—第12部分:樣品制備與參照樣品[S].2000.

[2] GB/ T16886.5 - 2003.醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)—第5 部分:細(xì)胞毒性試驗(yàn):體外法[S].2003.

[3] 國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局中國(guó)藥品生物制品檢定所.醫(yī)療器械檢驗(yàn)操作規(guī)范[S].北京:中國(guó)科學(xué)技術(shù)出版社,2005.

R765.21

B

1671-8194（2013）24-0066-02

*通訊作者