IL-23/IL-17炎癥軸在實驗性自身免疫性肝炎中的作用

李曉妮 鄧志華* 賀 靜 王 琪

（山西醫科大學第二醫院消化內科，山西 太原 030001）

IL-23/IL-17炎癥軸在實驗性自身免疫性肝炎中的作用

李曉妮 鄧志華* 賀 靜 王 琪

（山西醫科大學第二醫院消化內科，山西 太原 030001）

目的 通過建立實驗性自身免疫性肝炎小鼠模型，觀察外源性IL-23對實驗性自身免疫性肝炎模型小鼠中IL-17的影響，探討其可能的作用機制。方法 以肝抗原S-100免疫C57BL/6小鼠制作自身免疫性肝炎動物模型，提取出脾淋巴細胞，將IL-23加入到抗CD3抗體活化后的脾淋巴細胞中進行培養，免疫組化觀察IL-17在肝細胞中的分布及表達水平，RT-PCR和ELISA檢測IL-17在脾淋巴細胞中的表達。結果 與對照組相比，模型組肝細胞中IL-17表達升高；IL-23作用于模型組活化的脾淋巴細胞后IL-17的表達水平明顯高于對照組。結論IL-23/IL-17炎癥軸在EAH的病理機制中發揮著重要的作用，IL-23可能通過上調IL-17的表達使AIH模型小鼠癥狀加重，并為AIH的治療提供了新的靶點。

實驗性自身免疫性肝炎；白細胞介素17；白細胞介素23

自身免疫性肝炎（AIH）是一種慢性進行性肝臟炎癥性疾病，以匯管區淋巴細胞、漿細胞浸潤，并侵入肝臟實質，形成界面下肝炎的肝臟特異性組織學改變、高免疫球蛋白、循環自身抗體及對免疫抑制劑治療有所反應為其主要特征[1,2]，主要累及中老年婦女。近年來，國內外對AIH的研究十分活躍，其發病機制還尚未完全闡明。

Th17細胞為近年來新發現的CD4+T細胞亞型，它通過分泌IL-17A（即IL-17）、IL-17F和TNF-α等因子而在自身免疫性疾病中發揮重要的作用[3]。IL-17A作為IL-17家族的代表性因子，已經發現在多種自身免疫性疾病中均有不同程度的升高。有學者在研究原發性膽汁性肝硬化（PBC）發病過程中膽管的固有免疫作用時發現，Th17細胞相關的主要細胞因子IL-17在PBC患者膽管的慢性炎癥中發揮重要作用[4]。同時，也有研究發現PBC患者肝臟匯管區IL-17表達明顯增多[5]。國外報道體外誘導Th17細胞分化產生IL-17與多種細胞因子密切相關，其中IL-23在誘導其分化過程中起到十分關鍵的作用[6]。IL-23作為IL-12家族的新成員，在一些炎癥性自身免疫性疾病模型的形成和發展中起著十分重要的作用，如炎癥性腸?。↖BD）、自身免疫性腦脊髓膜炎（EAE）、膠原誘導的關節炎（CIA）、實驗性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）[7-11]。同時，也有實驗證明在這些疾病模型中IL-23可促進Th17細胞的分化、增殖，進一步促進IL-17的分泌[12]，這些結果說明了IL-23/IL-17通路在一些自身免疫性疾病的發病機制中起著一定的作用，但IL-23/IL-17在AIH疾病的發生、發展過程中的作用機制仍不清楚。為此，本研究建立EAH模型，旨在通過觀察IL-23對自身免疫性肝炎小鼠模型IL-17水平的影響，為揭示IL-17/IL-23炎癥軸在EAH發病機制中所起的作用提供一定的理論和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1640培養基（美國HyClone公司），兔抗小鼠IL-17A、羊抗兔IgG（武漢博士德生物工程有限公司），小鼠臟器組織淋巴細胞分離液（天津灝洋生物制品科技有限責任公司），小鼠白細胞介素-17ELISA試劑盒（武漢博士得生物工程有限公司），IL-23 小鼠CD3單抗（美國eBiosicience公司），FITC-標記羊抗小鼠IgG（H+L）（美國Earthax公司），佛氏完全佐劑（美國sigma公司），FastStart Universal SYRB Green Master（ROX）（TAKARA），IL-17A引物：上游：5’-CTGAT CAGGACGCGCAAAC-3’；下游：5’-TCGCTGCTGCCTTCACTGTA -3’，β-actin引物：上游：5’-AAGTGTGACGTTGACATCCG-3’；下游：5’-TCTGCATCCTGTCAGCAATG-3’ （TAKARA）。

1.2 建立動物模型

1.2.1 四周齡雄性清潔級C57BL/6小鼠50只購自北京軍事醫學科學院實驗動物中心，體質量（20±2）g。購回后飼養于山西醫科大學動物實驗中心，恒溫、恒濕條件下自由攝取食物和水，飼養1周左右后開始試驗。

1.2.2 抗原的準備

將10只雄性C57BL/6小鼠的肝臟取出，置冰上剪碎，生理鹽水反復沖洗除去血液，與等量的生理鹽水進行勻漿，勻漿后行超聲粉碎，使肝細胞內蛋白質充分釋出。將勻漿液以2000r/min離心10min以去除細胞核部分，收集上清液后超速離心機以241000r/min的速度離心1h。該上清液即含肝抗原，即S-100抗原。此抗原需在用前新鮮制備效果較好。

1.2.3 模型構建

將實驗動物按照數字分組法隨機分為2組，每組20只。第1組（對照組），第1天和第7d以0.5mL的生理鹽水與等體積的佛氏完全佐劑（CFA）充分乳化后予小鼠腹腔注射；第2組（模型組），第1天和第7天以新鮮制備的0.5～2.0g/L的S-100 0.5mL與等體積的CFA充分乳化后予小鼠腹腔注射。各組小鼠于第28天后處死。水合氯醛麻醉后摘取眼球采集外周血，以2000r/min離心10min后分離血清于-20℃短期保存待測，后脫頸處死小鼠，取出肝臟和脾臟組織，肝臟組織經10%的福爾馬林固定，石蠟包埋，切片待行肝臟組織HE染色，光鏡觀察。脾臟組織立即提取淋巴細胞。

1.2.4 C57BL/6小鼠自身免疫性肝炎造模成功的確定

處死小鼠后檢測模型組和正常對照組血清中的白蛋白、球蛋白、AIT、AST、TBIL、抗平滑肌抗體（SMA）和抗核抗體（ANA）的水平，肝臟組織的HE染色觀察炎癥程度。所有的這些結果可用來估計自身免疫性肝炎C57BL/6小鼠模型構建是否成功。

1.3 實驗方法

1.3.1 免疫組化

取小鼠肝臟組織標本經10%的中性甲醛固定后石蠟包埋切片，約4μm厚度，經梯度酒精固定、二甲苯脫蠟后，用3%的雙氧水阻斷內源性過氧化物酶，蒸餾水沖洗PBS浸泡后，枸櫞酸鹽緩沖液高溫修復，滴加山羊血清進行封閉，甩去血清后加兔抗小鼠（1∶200）后置于濕盒中4℃過夜孵育，PBS沖洗后滴加羊抗兔抗體，室溫孵育30min，PBS沖洗后加DAB顯色劑顯色，梯度酒精脫水、二甲苯透明后用中性樹膠封片。借助圖像分析系統對組織切片中的陽性細胞進行圖像分析。

1.3.2 脾臟淋巴細胞的提取和培養：

從小鼠體內取出脾臟，用PBS沖洗后，置于200M的尼龍網上研磨，研磨出的細胞過濾到盛有3mL的1640細胞培養基中，將含研磨后細胞的1640細胞培養基沿管壁緩慢加入到已盛有6mL淋巴細胞分離液的離心管中，2000r/min離心15min，收集淋巴細胞到另一離心管中，加入3mL的1640細胞培養基，再次離心，1500r/min離心15min后，棄掉上清液，加入含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素的1640細胞培養基，使細胞懸浮，計數后，將懸浮細胞接種至24孔細胞培養板中，每孔細胞數約（0.5～0.8）×106/mL。從一只小鼠提取出的脾淋巴細胞分三組：第一組空白組，細胞不予任何處理；第二組IL-23組，在0、24h、48h時加入20ng/mL的IL-23；第三組IL-23+抗CD3單抗組，加入2μg/mL的抗CD3抗體，并在0、24h、48h時加入20ng/mL的IL-23。將24孔板放于37℃、5%CO2培養箱中。

1.3.3 IL-17在細胞上清液中的表達水平

淋巴細胞在培養72h后，收集細胞上清液，-80℃凍存，檢測時取出，在室溫下放置20min以平衡室溫，用采用雙抗體夾心法ELISA試劑盒，嚴格按照操作說明的方法，檢測IL-17A在細胞上清液的水平，每個樣本設3個復孔。

1.3.4 熒光定量PCR

收集培養72h后的淋巴細胞，嚴格按照操作步驟進行操作：①總RNA的提?。簵壢ド锨?，按細胞1×107/mL加入1mL的RNAiso試劑提取總RNA；②將RNA反轉錄為cDNA；③在ABI Prism7300熒光定量PCR儀上兩步法進行擴增，擴增完成后設定基線值和閾值，讀取閾循環（Ct）值。采用2-△△Ct方法計算相對定量結果。PCR反應條件：95℃變性30s，95℃5s，60℃31s，共40個循環。每個樣本設3個復孔。

1.4 統計學分析

計量資料以均數±標準差表示，采用單因素方差分析進行多組均數間的比較，兩兩比較采用LSD檢驗。以P＜0.05表示差異具有統計學意義，采用SPSS17.0軟件進行統計學處理。

2 結 果

2.1 小鼠血清中ALT、AST、TBIL、A、G的含量變化以及抗核抗體的檢查，小鼠血清中ALT、AST、A、G含量比較，模型組與對照組相比，差異均有統計學意義（P＜0.05），雖然模型組血清中TBIL的含量較對照組的高，但兩者差異并無統計學意義（P＞0.05）（表1）。同時，在熒光顯微鏡下我們并未見到SMA特異性線性熒光，但可見到較為明顯的ANA特異性熒光。

表1 小鼠血清生化指標的檢測結果

2.2 小鼠肝臟組織病理變化

對照組小鼠肝細胞形態正常，以中央靜脈為中心向四周呈放射狀排列，肝小葉結構清晰，無炎性細胞浸潤。模型組小鼠均觀察到肝臟的不同病變，在肝小葉和匯管區可見到淋巴細胞和漿細胞浸潤為主的炎性反應，中間夾雜少量的中性粒細胞。部分細胞嚴重浸潤破壞了肝小葉的正常結構，可出現點狀壞死、片狀壞死（圖1）。

圖1-1 正常對照組小鼠血清中抗核抗體的表達(免疫熒光×200倍)

圖1-2 模型組小鼠血清中抗核抗體的表達(免疫熒光×400倍)

2.3 IL-17在自身免疫性肝炎小鼠肝細胞的表達

為研究IL-17在自身免疫性肝炎病理機制中的重要作用，我們通過免疫組化的方法分析IL-17A在肝細胞中的分布及表達水平。結果如圖2所示：正常對照組小鼠的肝細胞中幾乎沒有IL-17A的表達，而模型組小鼠的肝細胞中有明顯的IL-17A+細胞浸潤，并且IL-17A+細胞主要分布于匯管區和肝小葉區，并有大量的淋巴細胞浸潤。同時結果發現IL-17A+細胞的頻數與肝臟的炎性程度成正相關（r=0.70，P＜0.01）。

2.4 IL-17A在淋巴細胞上清液中的表達

模型組和對照組的淋巴細胞在相同條件下分組進行培養后，收集細胞上清液后經ELISA檢測發現：空白組中，模型組培養的淋巴細胞上清液中IL-17A的含量較對照組中的高，兩者有統計學差異（P＜0.01）；在IL-23組和IL-23+抗CD3單抗組中，與對照組相比較，模型組細胞上清液中IL-17A的含量顯著升高（P＜0.05）；而且，在模型組中，經IL-23刺激活化后淋巴細胞的上清液中IL-17A的含量明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.01）（圖2，表2）。

圖2-1 正常對照組小鼠肝組織(HE×100倍)

圖2-2 模型組小鼠肝組織(HE× 400倍)

表2 上清液中IL-23對IL-17A表達的影響（濃度pg/mL）（n=18）

2.5 IL-17A mRNA在淋巴細胞中的表達水平

熒光定量PCR檢測結果：空白組中，模型組培養的淋巴細胞中IL-17A mRNA水平比對照組的高，兩者差異有統計學意義（P＜0.01）；在IL-23組和IL-23+抗CD3單抗組中，與對照組相比較，模型組淋巴細胞中IL-17A mRNA的表達水平升高（P＜0.01）；且在模型組中，IL-23刺激活化后比刺激未活化更高，二者差異有統計學意義（P＜0.01）（表3）。

表3 淋巴細胞中IL-23對IL-17A mRNA表達的影響（Ct）（n=17）

圖3-1 正常對照組小鼠肝組織(免疫組化×400倍)

圖3-2 模型組小鼠肝組織(免疫組化×400倍)

3 討 論

近年來，AIH的發生率逐漸上升，引起人們的廣泛關注，但其病因及發病機制仍不清楚，而缺乏典型的AIH動物模型可能是其主要原因之一。AIH動物模型的構建方法有多種，目前比較經典的主要有以下四種：肝抗原、刀豆蛋白A（ConA）、α-半乳糖基神經酰胺（α-GalCer）誘導的肝炎動物模型和轉基因小鼠模型。其中，ConA和α-GalCer更傾向于誘導肝臟的急性炎性反應，且所產生的炎性細胞因子維持時間較短，與人AIH的特點不相符合，而轉基因小鼠雖然是近年來的研究熱點，但是由于肝臟作為AIH的靶器官，存在強大的免疫耐受，難以建立成功的AIH模型，且造模的方法比較復雜，所以，基于以上原因，我們采用易感動物C57BL/6小鼠，以S-100肝抗原與佛氏完全佐劑充分乳化后，2次腹腔注射即誘導出實驗性自身免疫性肝炎。操作方法簡單，且免疫持續時間較久，肝臟組織學改變與人自身免疫性肝炎的組織學特征相似，均有大量炎性細胞浸潤，以淋巴細胞為主，伴肝細胞點狀、片狀壞死，同時模型組小鼠血清中A/G比值倒置、轉氨酶升高、血清中抗核抗體（ANA）陽性均符合臨床病例特點。綜合上述證明該模型是成功的實驗性自身免疫性肝炎小鼠模型。

Th17細胞是新近發現的一種區別于Th1和Th2的輔助性T細胞，其在表現、功能和形成途徑都與其他兩種不同[13]。而IL-17作為Th17細胞分泌的關鍵性促炎因子，通過誘導纖維母細胞、內皮細胞、巨噬細胞和上皮細胞分泌多種炎癥介質和趨化因子，募集中性粒細胞誘導炎癥發生，引起組織損害[14]。近來，越來越多的實驗發現IL-17在肝臟的炎癥作用中發揮一定的重要性。原發性膽汁性肝硬化（PBC）病人外周血中IL-17和肝臟中IL-17+細胞都明顯增多[15]。國外已有研究報道IL-17在一些自身免疫性疾病的發病機制中起著十分重要的作用，如類風濕關節炎（RA）[16]、EAE[17]、IBD[18]、系統性紅斑狼瘡（SLE）[19]。事實上，已有研究發現IL-17在一些肝臟疾病的病理機制中發揮一定的作用[20]，但它在AIH中的作用仍不清楚。在本實驗中，我們發現與對照組相比，在EAH小鼠中IL-17A的蛋白和分子水平明顯升高。而且，在EAH小鼠的肝臟中存在明顯的IL-17A+細胞浸潤，IL-17A+細胞的表達與炎癥程度成正相關。我們的實驗說明IL-17A可能與EAH的發病機制相關。

IL-23是新近發現的細胞因子，與IL-12共同分享IL-12p40和IL-12Rβ1亞單位[21]，但其功能和作用與IL-12不同。研究發現IL-23受體只在活化的輔助T細胞和記憶T細胞中表達，對于Th17細胞的存活、增殖以及IL-17的分泌至關重要。近年來，越來越多的實驗證實IL-23參與的Th17細胞引起的炎性反應即IL-23/IL-17炎癥軸被認為在自身免疫性疾病的發生、發展中起著至關重要的作用[22]，但IL-23與IL-17在AIH疾病中的相互關系仍不清楚。本實驗中，與對照組相比，模型組中IL-23可促進活化的淋巴細胞分泌IL-17A，使其表達量明顯升高。而對未活化的淋巴細胞中IL-17的作用則不十分明顯。這些結果說明了IL-23可能通過上調活化的淋巴細胞中IL-17A的表達而在EAH疾病的發病機制中發揮獨特的作用。研究發現在IBD、多發性硬化和自身免疫性葡萄膜炎各自的臨床表現、病理特征以及自身抗體都不相同，但有研究指出在這些自身免疫性疾病中IL-23和IL-17的表達都上調[23,24]，可以說IL-23/IL-17可能是這些自身免疫性疾病的一個獨特的炎癥通路，而這個炎癥通路可能為這些自身免疫性疾病提供新的治療策略。本實驗僅說明IL-17在EAH小鼠中的表達升高，IL-23可能通過上調活化的淋巴細胞中IL-17A而發揮作用，但并未對IL-23在EAH中的表達以及IL-23和IL-17之間的相關性進行分析，同時對于研究IL-23可誘導Th17細胞分泌IL-17炎性因子的轉錄機制也很關鍵，這些都有待于進一步研究。

總之，IL-23/IL-17炎癥通路在EAH小鼠的發病機制中有著十分重要的作用，更深層次的理解IL-23/IL-17炎癥通路可能對于AIH疾病的治療和預防提供新的靶點。

[1] Krawitt EL.Autoimmune Hepatitis[J].N Engl J Med,2006,354(1): 54-66.

[2] Manns MP,Vogel A.Autoimmune hepatitis,from mechanisms to therapy[J].Hepatology,2006,43(S1):S132-S144.

[3] Harrington LE,Hatton PR.Interleukin 17-producing CD4+effector T cells develop via a lineage distinct from the T helper type 1 and 2 lineages[J].Nat Immunol,2005,6(11):1123-1132.

[4] Harada K,Shimoda S,Sato Y,et al.Periductal interleukin-l7 production in association with biliary innate immunity contributes to the pathogenesis of cholangiopathy in primary biliary cirrhosis[J].Clin Exp Immunol,2009,157(2):26l-270.

[5] Lan RY,Salunga TL,Tsuneyama K,et al.Hepatic lL-17 responses in human and murine primary biliary cirrhosis[J].Autoimmun, 2009,32(1):43-5l.

[6] Volpe E,Servant N,Zollinger R,et al.A critical function for transforming growth factor-β,interleukin 23 and proinflammatory cytokines in Driving and modulating human TH-17 responses[J]. Nat Immunol,2008,9(6):650-657.

[7] Langrish CL,Chen Y,Blumenschein WM,et al.IL-23 drives a pathogenic T cell population that induces autoimmune inflammation [J].Exp Med,2005,201(2):233-240.

[8] Yen D,Cheung J,Scheerens H,et al.IL-23 is essential for T cellmediated colitis and promotes inflammation via IL-17 and IL-6[J]. Clin Invest,2006,116(5):1310-1316.

[9] Cua DJ,Sherlock J,Chen Y,et al.Interleukin-23 rather than interleukin-12 is the critical cytokine for autoimmune inflammation of the brain[J].Nature,2003,421(6924):744-748.

[10] Murphy CA,Langrish CL,Chen Y,et al.Divergent pro- and antiinflammatory roles for IL-23 and IL-12 in joint autoimmune inflammation[J].Exp Med,2003,198(12):1951-1957.

[11] Caspi R,Silver P,Cua D,et al.IL-23 and IL-17 in pathogenesis of experimental ocular autoimmunity: requirement for IL-23 may extend beyond its role in sustaining the IL-17 effector response[J]. Immunol,2007,178(4):129.

[12] Wilson NJ,Boniface K,Chan JR,et al.Development,cytokine profile and function of human interleukin 17-producing helper T cells[J]. Nat Immunol,2007,8(9):950-957.

[13] Korn T,Bettelli E,Oukka M,et al.IL-17 and Th17 Cells[J].Annu Rev Immunol,2009,27:485-517.

[14] Stockinger B,Veldhoen M.Differentiation and function 0f Th17 T cell[J].Curr Opin Immunol,2007,19(3):281-286.

[15] Lan RY,Salunga TL,Tsuneyama K,et al.Hepatic IL-17 responses in human and murine primary biliary cirrhosis[J].J Autoimmun, 2009,32(1):43-51.

[16] Colin EM,Asmawidjaja PS,Van Hamburg JP,et al.1,25-Dihydmxyvitamin D3modulates Thl7 polarization and interleukin-22 expression by memory T cells from patients with early theumatoid arthritis[J].Arthritis Rheum,2010,62(1):132-142.

[17] Komiyama Y,Nakae S,Matsuki T,et al.IL-17 plays an important role in the development of experimental autoimmune encephalomyelitis[J].J Immunol,2006,177(1):566-573.

[18] Niess JH,Leithanser F,Adler G,et al.Commensal gut flora drives the expansion of proinflammatory CD4+T cells in the colonic lamina propria under normal and inflammatory conditions[J].J Immunol,2008,180(1):559-568.

[19] Wong CK,Lit LC,Tam LS,et al.Hyperproduction of IL-23 and IL-17 in patients with systemic lupus erythematosus:implications for Th17-mediated inflammation in auto-immunity[J].Clin Immunol,2008,127(3):385-393.

[20] Bertolino P.Interleukin-22,interleukin-17,and other cytokines:a wall is coming down[J].Hepatology,2008,47(1):345-348.

[21] Oppmann B,Lesley R,Blom B,et al.Novel p19 protein engages IL-12p40 to form a cytokine,IL-23,with biological activities similar as well as distinct from IL-12[J].Immunity,2000,13(5):715-725.

[22] Kikly K,Liu I,Na S.The IL-23/Th(17)axis:therapeutic targets for autoimmune inflammation[J].Curr Opin Immunol,2006,18(6):670-675.

[23] Amadi-Obil A,Yu C,Liu X,et al.TH17 cells contribute to uveitis and scleritis and are expanded by IL-2 and inhibited by IL-27/ STAT1[J].Nat Med,2007,13(6):711-718.

[24] Schmidt C,Giese T,Ludwig B,et al.Expression of interleukin-12 related cytokine transcripts in inflammatory bowel disease: elevated interleukin-23p19 and interleukin-27p28 in Crohn’s disease but not in ulcerative colitis[J].Inflamm Bowel Dis,2005,11(1):16.

The Role of IL-23/IL-17 in Experimental Autoimmune Hepatitis

LI Xiao-ni, DENG Zhi-hua*, HE Jing, WANG Qi
(Department of Gastroenterology, The Second Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001,China)

Objective To investigate the variation of IL-17 in the model mice of experimental autoimmune hepatitis with exogenous IL-23 for its possible pathogenesis. Methods The C57BL/6 mice were immunized with S-100 to establish the model of experimental autoimmune hepatitis (EAH), the distribution and the expression levels of cytokines (IL)-17 in the murine liver using immunohistochemical method and lymphocyte from murine spleen were activated with anti-CD3antibody and treated with IL-23 in vitro, the cytokines, IL-17 were detected using reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and ELISA. Result The results were compared with those of normal controls, the expression of IL-17 were increased；We demonstrated that there were significantly increased IL-17A+ cells in livers of AIH mice, compared to normal mice using immunohistochemical method, and the expression of IL-17A was significant increase after treatment with IL-23 vs the non-IL-23-treatment control group and the cultured cells both were activated with anti-CD3antibody in AIH mice. Conclusion Our findings indicate that the IL-23/IL-17 inflammation axis play an important role in the pathogenesis of AIH, IL-23 on EAH may up-regulate the expression of IL-17 to accelerate the progress EAH, and which might be a target for treatment.

Experimental autoimmune hepatitis; IL-17; IL-23

R512.6

B

1671-8194（2013）24-0012-04

*通訊作者：E-mail:ykdzh@yahoo.com.cn