戴氏綠僵菌變種拮抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的作用

余 瑛，張孝彬，陳玉燕，楊艷紅

(重慶理工大學藥學與生物工程學院，重慶 400054)

蟲草是一類復型真菌，其無性型產生的次級代謝產物具有抗菌、抗病毒、抗癌、殺蟲、調節機體免疫、抗氧化［1］等作用，在醫藥領域有很大的應用潛力。戴氏綠僵菌變種Metarhizium taii var.chongqingensis nov(M.taii var)是一種低海拔地區蟲草的無性型菌株。本文報道了M.taii var發酵產物拮抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin resistant Staphylococcus aureus，MRSA)的初步研究結果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

供試菌:M.taii var，由重慶理工大學楊艷紅分離保存。

病原菌:MRSA標準菌株WHO2、臨床分離的金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，SA)共10株，由第三軍醫大學西南醫院惠贈。

1.1.2 培養基

1)PDA固體培養基:馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂 15 g，pH=7.0，去離子水定容至 1 000 mL。

2)細菌培養基:胰蛋白10 g，酵母粉5 g，氯化鈉 5 g，Ph=7.0，去離子水定容至 1 000 mL。

3)抑菌平板培養基:胰蛋白10 g，酵母粉5 g、氯化鈉5 g，瓊脂30 g，去離子水定容至1 000 mL。

4)生長發酵培養基:NaNO30.5 g，KCl 0.5 g，蔗糖 30 g，蠶蛹粉 0.5 g，pH=6.5，去離子水定容至1 000 mL。

5)發酵培養基:葡萄糖10 g，蛋白胨2.5 g，酵母粉 5 g，pH 值為 6.0 ～7.0，去離子水定容至1 000 mL。

1.1.3 主要試劑

蛋白酶K，購自鼎國生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 供試菌種的活化

取-80℃冰箱保存的供試菌 M.taii var，在PDA平板上劃線接種，于28℃培養14 d至孢子發育成熟。

1.2.2 供試菌的發酵培養

孢子懸液的制備:從PDA平板上刮取孢子，用無菌水重懸成孢子懸液后以4層無菌擦鏡紙過濾孢子液，血球計數板計數孢子，并調整孢子懸液濃度為109cell/mL。

接種及發酵:取100 μL孢子懸液接種到100 mL生長培養基中。培養2 d后，按1∶10接種至發酵培養基中。發酵培養條件優化應用正交設計法，采用2組變量:發酵培養基 pH 值為5.5、6.0、6.5、7.0;培養溫度為 25℃、28℃、30℃。發酵培養3～9 d，每日取發酵上清2 mL，10 000 r/min離心5 min，取上清進行抗WHO2的活性測定。

1.2.3 病原菌的培養

挑取活化的WHO2或各臨床分離的SA單克隆分別接種于 100 mL細菌培養基，37℃，250 r/min過夜培養，備用。

1.2.4 抑菌活性測定

M.taii var發酵上清拮抗WHO2的活性測定采用瓊脂擴散法［2］。將過夜培養的 WHO2，用血球計數板計數調整濃度為104個/mL，用移液槍吸取100 μL菌液，均勻涂布到抑菌平板培養基上。用打孔器在培養基上打孔，孔中加入發酵上清液150 μL，于37℃恒溫培養箱中放置培養12 h，測定抑菌圈直徑大小。

臨床分離的SA對甲氧西林敏感性測定結果由西南醫院提供。SA對M.taii var發酵上清的敏感性采用瓊脂擴散法測定。

1.2.5 高溫及蛋白酶K對M.taii var發酵上清活性的影響

將發酵液上清分別在45℃、65℃、85℃、100℃各處理5 min、10 min、15 min，測定抑菌活性。用未經高溫處理的發酵液上清作對照。

分別在100 μL發酵液上清中加入質量體積分數為10 mg/mL蛋白酶 K 50μL，37℃各孵育30 min、60 min，測定抑菌活性。用未加入蛋白酶 K發酵液上清作對照。

2 結果與分析

2.1 發酵溫度及pH對M.taii var發酵上清抗菌活性成分表達的影響

在前期已對培養基進行篩選的基礎上，采用不同pH的發酵培養基和發酵溫度進行培養，提取發酵上清測定抑菌活性，結果(見表1)表明:30℃，pH值為5.5～6.0條件最適合抑菌成分的表達，該條件下發酵上清的抑菌活性最先達到峰值，即發酵7 d時抑菌圈直徑達到3.6 cm，其活性高于其他條件下的發酵上清。

表1 不同培養溫度、pH條件下M.taii var發酵上清拮抗MRSA的活性

2.2 高溫對M.taii var發酵上清抗菌活性的影響

將M.taii var發酵上清分別用45℃、65℃、85℃、100℃處理后，測定其抑菌活性變化，結果顯示:不同溫度處理后 M.taii var發酵上清拮抗WHO2的抑菌圈直徑無顯著變化(見圖1)，即M.taii var發酵上清中的抑菌成分在高溫條件下活性穩定。

2.3 蛋白酶K對M.taii var發酵上清抗菌活性的影響

在M.taii var發酵上清中加入蛋白酶K，37℃孵育30 min或60 min后測定其抑菌活性變化，結果顯示:處理后的M.taii var發酵上清拮抗WHO2的抑菌圈大小無顯著變化(見圖2)，即蛋白酶K對M.taii var發酵上清中的抑菌成分活性無影響。

2.4 M.taii var發酵上清對各臨床分離SA的拮抗作用

測定M.taii var發酵上清對各臨床分離SA的抗菌活性，結果顯示該發酵上清對臨床分離的SA菌株均有拮抗作用，其抑菌圈直徑在3.4～3.6 cm(表2未顯示)，這些被檢測的SA中有對甲氧西林耐受菌株即MRSA菌株，也有對甲氧西林敏感的SA菌株(見表2)。

圖1 M.taii var抑菌成分在高溫處理后的穩定性

表2 M.taii var發酵上清對臨床分離SA的抗菌活性

圖2 M.taii var發酵上清抑菌成分經蛋白酶K消化后的活性

3 討論

SA是引起細菌性食物中毒和化膿感染最常見的病原菌之一。自19世紀40年代青霉素問世以來，SA引起的感染性疾病受到較大的控制。但隨著青霉素的廣泛使用，有些SA產生了一種能水解β-內酰胺環的酶，可使青霉素無效，即產生了耐藥性。隨后推出的甲氧西林在臨床使用2年后就出現了耐甲氧西林的菌株MRSA［3］。目前，MRSA已成為院內感染的重要病原菌之一。耐藥菌株的不斷出現，使得MRSA治療藥物變得日益匱乏，尋找新的抗MRSA活性物質來源是進行新型抗MRSA藥物研發的工作基礎。本研究研究證實M.taii var發酵上清對臨床分離的不同MRSA菌株及普通SA菌株都有抗菌活性，表明M.taii var產生的抗菌成分與甲氧西林有不同的抗菌機制，該活性物該抗菌成分還有耐高溫和抗蛋白酶K水解的特性，在pH值為5.6～6.0，溫度為30℃時表達活性最高。已有的研究結果顯示綠僵菌、白僵菌等真菌的次生代謝產物中含有一種結構為環肽的綠僵菌素(destruxins，Dtxs)［4-5］，具有抗菌、抗蟲、抗腫瘤、抗炎癥、抗骨質疏松、免疫抑制等多種活性［6］，Dtxs結構均由一個α-羥酸和5個氨基酸殘基構成，不同菌株來源的Dtxs的α-羥酸類型、N-甲基化修飾、氨基酸側鏈基團有所不同，均有耐高溫、抗蛋白酶水解的特性［7］。M.taii var抗MRSA是否含有與先前報道的DTXs類似的結構仍需進一步研究。

［1］焦彥朝，梁宗琦，劉愛英.蟲草生物活性物質研究概況［J］.貴州農業科學，1990(3)：53-58.

［2］周長林.微生物學實驗與指導［M］.北京：中國醫藥科技出版社，2008.

［3］Jensen J U S，Jensen E T，Larsen A R，et al.Control of a methicillin-resistant Staphylococcus aureus(MRSA)outbreak in a day-care institution［J］.Journal of Hospital Infection，2006，63(1)：84-92.

［4］Peng K C，Huang H S，Teng Y M，et al.Circular dichroism analysis of destruxins from Metarhizium anisopliae O-riginal Research Article［J］.Journal of Biochemical and Biophysical Methods，2005，62(1)：41-50.

［5］Morais-Urano R P，Chagas A C S，Berlinck R G S，et al.Acaricidal action of destruxins produced by a marine-derived Beauveria felina on the bovine tick Rhipicephalus(Boophilus)microplus［J］.Experimental Parasitology，2012，132(3)：362-366.

［6］Sarabia F，Chammaa S，Sánchez-Ruiz A，et al.Chemistry and biology of cyclic depsipeptides of medicinal and biological interest［J］.Curr Med Chem，2004(11)：1309.

［7］Asai T，Yamamoto T，Chung Y M，et al.Aromatic polyketide glycosides from an entomopathogenic fungus［J］.Cordyceps indigotica Tetrahedron Letters，2012，53：277-280.