蒼鷺致病性沙門菌的分離鑒定及藥敏試驗

冷 闖，鄧舜洲，張文波，蔣新華

（江西農業大學動物科學技術學院，江西 南昌330045）

沙門菌病（Salmonellosis）是由沙門菌屬中的一種和幾種致病沙門菌（Salmonella）引起的人和多種動物感染的急性和慢性疾病的總稱，是公共衛生學上具有重要意義的人畜共患病之一［1］。美國總統奧巴馬支持了歐洲食品安全局的觀點，認為沙門菌是引起人類食源性傳染病的重要原因，而農場飼養的動物和動物源性食品是人類沙門菌病的重要傳染源［2］。蒼鷺（Ardea cinerea）屬鸛形目，鷺科、鷺屬，是一種中型涉禽，在遼寧為夏候鳥［3］。養殖戶由于缺乏珍禽養殖技術造成重大經濟損失。2001年4月江西省九江市鄱陽湖地區某規模在1 500只左右的蒼鷺養殖場，每天死亡蒼鷺30只左右，日齡在15日齡到20日齡，并且死亡數量呈遞增趨勢，本實驗室對送檢的10只患病蒼鷺進行系統診斷，確定為沙門菌所致。

1 試驗材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 高壓滅菌器、恒溫培養箱、顯微鏡、搖床、冰箱。

1.1.2 培養基 普通肉湯液體培養基，S.S.瓊脂培養基，麥康凱瓊脂培養基，8%兔鮮血脫纖維瓊脂培養基。培養基均為江西農業大學動物科技學院預防獸醫實驗室自配，并檢驗合格。

1.1.3 藥敏紙片 環丙沙星、左氧氟沙星、青霉素G、四環素、紅霉素、甲氧芐啶、頭孢曲松、林可霉素、阿米卡星頭孢唑林、氧氟沙星、利福平、哌拉西林、多黏菌素B、壯觀霉素、頭孢拉定、卡那霉素、呋喃唑酮、氨芐青霉素、強力霉素、慶大霉素。藥敏紙片直接均為6mm左右，以上藥敏紙片，購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.1.4 微量生化管 硫化氫、肌醇、水楊苷、枸櫞酸、葡萄糖、甘露醇、側金花、硝酸鹽、蔗糖、精氨酸、V－P、七葉苷、阿拉伯糖、麥芽糖、乳糖、鳥氨酸。以上微量生化管，購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.1.5 試驗動物 6周齡雌性昆明系小鼠5只，購自南昌大學實驗動物部。

1.2 試驗方法與步驟

1.2.1 病料采集 送檢的病蒼鷺進行查看，觀察到蒼鷺肛門下方羽毛都被白色糞便糊住，拉稀很嚴重，剖檢后仔細查看病理變化，發現所有剖檢的病例都存在肝臟腫大，出血嚴重，脾臟腫大，腸道漿膜出血，肌胃與腺胃交界處片狀出血非常嚴重。挑取病變最典型的肝臟進行細菌分離。并且做好記錄，拍照留底。

1.2.2 細菌分離及純化 剖檢后采取肝臟用劃線接種法接種于8%兔鮮血脫纖維瓊脂培養基上，置于37℃恒溫培養箱中，培養12～24h，進行革蘭染色、鏡檢，觀察細菌形態。根據菌落形態及顯微鏡觀察結果，再挑取單個典型菌落劃線接種于8%兔鮮血脫纖維瓊脂平板37℃進行多次純化培養。

1.2.3 初步鑒定 通過多次細菌分離純化后，挑取最典型的菌落進行涂片、革蘭染色以及鏡檢，首先通過肉眼觀察培養基上細菌菌落形態、大小、透明度以及借助顯微鏡觀察細菌的特征。

1.2.4 培養特性觀察 在純培養平板上挑取典型菌落用劃線接種法分別接種于S.S.瓊脂培養基、麥康凱瓊脂培養基置于37℃恒溫培養箱中，培養12～24h，觀察長出細菌的菌落形態以及在各種培養基上的生長情況。

1.2.5 擴大培養 將普通液體肉湯培養液分裝于10支高壓滅菌的試管中，挑取兔鮮血平板上分離純化后的單個菌落于液體培養基中，操作時注意無菌條件，接種完后把試管放進搖床中進行擴大培養，條件是37℃，200r／min，培養24h。

1.2.6 試驗動物攻毒 用擴大培養的菌液進行小鼠腹腔注射，兩只小鼠注射0.5mL，兩只小鼠注射0.2mL，1只小鼠注射0.5mL滅菌生理鹽水作為對照，攻毒時注意腹腔注射盡量避免把菌液注射到小鼠皮下，影響小鼠發病及死亡時間，做好染色標記。

1.2.7 試驗動物剖檢及細菌分離 小鼠攻毒之后注意觀察其精神狀態和死亡情況，待小鼠死亡后，采用常規剖檢方法先將小鼠腹腔打開，再打開胸腔，觀察各個臟器的病理變化，摘下肝臟以備分離細菌所用，待剖檢后，進行細菌分離操作，以上操作都要求無菌。

1.2.8 致病菌的鑒定 從死亡小鼠肝臟分離的細菌進行革蘭染色鏡檢，對比從原始病料中分離的細菌，最終確定是否是主要致病菌。

1.2.9 生化鑒定 通過純培養的細菌選擇典型菌落接種于8%兔鮮血瓊脂固體試管斜面培養基上置于37℃恒溫培養箱中培養12～24h，用鉤菌環挑選典型單個菌落接種于微量生化鑒定管中，接種完后，微量生化管放于滅菌平皿中切忌要保持水平放置，置于37℃恒溫培養箱中，培養24～48h，進行觀察，記錄結果。

1.2.10 藥敏試驗 采用瓊脂紙片擴增法，用高壓滅菌后的棉拭子蘸取擴大培養后的菌液均勻涂布于8%兔鮮血瓊脂培養基上，為了保證涂布均勻，需要重復涂布3次，待水分干后，貼上藥敏紙片，輕輕按壓，確保其貼穩，防止掉落和移動，注意用鑷子夾取藥敏紙片貼于平板上時要確保藥敏紙片完全與培養基接觸，以免影響藥物擴散不均勻。一個平皿貼7片紙片，最中間一塊，其余6塊均勻分布其周圍。貼好藥敏紙片后放入37℃恒溫箱中培養12～24h，觀察測量抑菌圈的大小，抑菌圈≧20mm為極度敏感；15～20mm為高度敏感；14～10mm為中度敏感；10mm以下大于0為低度敏感；等于0為不敏感。藥敏試驗操作方法按2005年版CLSI／NCCLS M100－S15所述方法進行。

2 試驗結果

2.1 病原菌的鑒定 從蒼鷺肝臟分離的細菌在8%兔鮮血瓊脂培養基上置于37℃恒溫箱中培養12～24h，生長菌落形態都為邊緣整齊、光滑、濕潤、半透明、略隆起的細小圓形菌落，沒有出現溶血環；S.S.瓊脂培養基上細菌生長良好，長成半透明、圓形、菌落中間有黑點的小菌落；在麥康凱培養基上都長出半透明、光滑小菌落，挑取典型菌落進行革蘭染色，結果為革蘭陰性菌，形態都為長桿狀或短桿狀菌落，多數散在。通過細菌形態觀察、染色鏡檢及生化鑒定結果最終得出該細菌為沙門菌。

2.2 試驗動物攻毒 將細菌擴大培養物對小鼠進行腹腔注射后，小鼠全部在12h之內死亡，表中死亡時間為2只小鼠平均死亡時間，具體結果見表1。

表1 動物攻毒試驗

2.3 試驗動物病理剖檢及致病菌鑒定 通過對死亡小鼠進行病理剖檢均發現小鼠肝臟腫大、壞死，心外膜少量點狀出血，腸道黏膜嚴重出血，腸壁變薄、變黃，臌氣。剖檢完死亡小鼠取下其肝臟進行細菌分離，置于37℃恒溫培養箱中進行培養，挑取單個菌落進行革染色再鏡檢觀察，發現菌落形態大小、色澤都和原分離菌一致，鏡檢也發現和原分離菌的形態相同，因此得出原分離細菌為該病例主要致病菌。

2.4 生化鑒定結果 見表2。

2.5 藥敏試驗結果 見表3。

表2 生化鑒定

表3 藥敏試驗

3 討論

沙門菌病和大腸桿菌病屬于條件致病菌，人和動物的沙門菌病一直是一個世界性問題［4］，沙門菌菌型繁多，分布廣泛，是一種重要的人畜共患病的病原體［5］。沙門菌對于我國畜牧業的威脅越來越大，而且沒有很好的有效控制辦法，長期以來，以治療、預防疾病和促進畜禽生長為目的，不合理使用抗生素，導致抗生素過度使用或濫用，在抗生素的選擇性壓力下，沙門菌耐藥性不斷上升，這已成為嚴重的公共衛生問題［6］。據相關文獻［1］指出，沙門菌耐藥的生化反應機制主要有5種：酶對抗菌藥物的修飾或破壞；外輸泵介導抗菌藥物的主動外排；抗菌藥物的滲透障礙，導致藥物攝取減少；藥物作用靶位的改變；建立新代謝途徑，沙門菌發生耐藥性常常不是一種生化反應機制起作用，而是兩個或多個不同的生化反應機制共同作用。從而可以看出，要解決沙門菌的耐藥性問題面臨非常嚴峻的挑戰。

本試驗分離到的沙門菌可能是由于種蛋帶毒或者是由于野生放養于沼澤地而感染沙門菌，鑒于這種可能性，必須對種蛋和沼澤地的泥水進行檢測，鑒于我國國情，在生產中常用國標法，有條件的單位應用自動酶標檢測儀，ELISA，PCR試劑盒檢測［7］，做到從源頭消滅病原菌，才能更好地控制沙門菌病。蒼鷺養殖屬于特種經濟動物養殖，養殖規模小，養殖戶數量少，可以借鑒的經驗更是很少，很多經驗都是靠養殖戶自己摸索，這無疑會走很多彎路，本試驗得出的一些數據可能對于蒼鷺養殖能起到一個參考作用。

鑒于本試驗得出的結論，對該病例的治療與預防提出以下建議措施：用環丙沙星、左氧氟沙星、氧氟沙星、甲氧芐啶進行交替使用拌料和飲水，使用多維、中草藥等增強免疫力的藥物進行輔助治療；盡量減小養殖密度，保持空氣流通；對于投喂的魚粉飼料要進行把關檢測，防治霉變及病菌污染。

［1］張凌云，李昆鵬，張林波.沙門菌生化耐藥機制的研究進展［J］.吉林農業，2011，3（253）：64.

［2］Roger Mann，Anitox.salmonella control in the spotlight［J］.Pig progress，2010，26（1）：18－20.

［3］袁宏宇，周正，任秀奇，等.蒼鷺繁殖生態習性研究［J］.遼寧林業科技，2003，6：10－12.

［4］Kerstein F K，Motarjemi Y，Bettcher.Foodborne disease control：A transnational challenge.Emerging Infectious disease.http：／lwww.cdc.gov／foodsafety／facts.html.

［5］Timoth，Jones，Diane Eigsti Gerber，Perceived Etiology of Foodborne Illness Among Public Health personnel，http：／／www.cdc.gov／ncidod／disease／eid／index.Htm.

［6］王曉泉，焦新安，陳祥，等.江蘇部分地區食源性和人源沙門菌的多重耐藥性研究［J］.微生物學報，2007，47（2）：221－227.

［7］孫雨，卜仕金，王美君.沙門菌的毒理作用機制及其檢測方法的研究進展［J］.口岸衛生控制，2008，14（2）：56－58.