UPLC／Q－TOF MS法檢測和鑒定腫瘤患者血漿和尿中阿帕替尼代謝物

曹廣美 （山東大學藥學院，山東 濟南 250012）

甲磺酸阿帕替尼（apatinib，YN968D1）是一種新型口服小分子血管內皮生長因子受體（VEGFR）酪氨酸激酶抑制劑（TKI）［1－2］，由恒瑞醫(yī)藥股份有限公司開發(fā)，目前處于III期臨床試驗階段，用于胃癌、肺癌、乳腺癌等適應證的治療。阿帕替尼與同類藥瓦他拉尼（valatinib，PTK787）和舒尼替尼（sunitinib）相比顯示出更高的體外和體內活性，且在安全性上更優(yōu)。目前阿帕替尼在人體內代謝過程尚未見研究報道。本實驗用UPLC／Q－TOF MS法鑒定阿帕替尼在腫瘤患者血漿和尿中的代謝物，確定阿帕替尼人體內主要代謝途徑，可為后期進一步新藥開發(fā)提供參考［3］。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 Acquity Ultra超高效液相色譜系統(tǒng)及Synapt Q－TOF質譜儀，配有ESI源及 Masslynx V4.1、MetaboLynx、MassFragmentTM等數據處理軟件（美國Waters公司）。

1.1.2 藥品與試劑 甲磺酸阿帕替尼（批號20101117，純度99.8%）、順式－3－羥基阿帕替尼（批號501－000，純度94.7%）、反式－3－羥基阿帕替尼（批號UTP0137，純度96.8%）均由江蘇恒瑞醫(yī)藥有限公司提供；二磷酸尿苷葡萄糖醛酸（UDPGA，美國Sigma公司）；人肝微粒體（HLM，美國BD公司）；還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH，德國羅氏公司）；β－葡萄糖苷酸酶（101300Units·g－1，美國Sigma公司）；鹽酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、Tris均為分析純；乙腈、醋酸銨、甲酸均為色譜純，水為Millipore超純水。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 Acquity UPLC HSS T3色譜柱（2.1mm×100mm×1.8μm）；柱溫：40℃；流動相：A（5 mmol·L－1醋酸銨水溶液含0.05%甲酸），B（乙腈）；流速0.45 mL·min－1；采用梯度程序洗脫。

1.2.2 質譜條件 ESI電離源，正離子方式檢測，霧化氣流量700L·h－1，去溶劑溫度350℃，離子源溫度100℃，毛細管電壓3.5 kV。低能量掃描時傳輸碰撞能量3 eV，阱碰撞能量5 eV；高能量掃描時傳輸碰撞能量8 eV，阱碰撞能量8～10eV。質量掃描范圍m／z80～1 000。

1.2.3 樣品采集 5名胃癌患者每天一次口服給予850mg甲磺酸阿帕替尼片，連續(xù)28 d。于第28天給藥后4 h和6 h采集血漿樣品。收集一名乳腺癌患者給藥后11 h尿樣。

1.2.4 樣品處理 取同一時間點不同受試者血漿樣品各100μL合并，作為合并血漿樣品。取200μL合并血漿，乙腈沉淀蛋白處理后采用UPLC／Q－TOF MS分析；取50μL尿樣，乙腈沉淀蛋白處理后采用 UPLC／Q－TOF MS分析。

1.2.5 人肝微粒體（HLM）孵化實驗 I相代謝孵化實驗：孵化介質為100mmol·L－1磷酸緩沖液（pH 7.4），孵化體系包括1 mg·mL－1的 HLM，2 mmol·L－1的 NADPH，終濃度為2.0μmol·L－1的阿帕替尼、順式－3－羥基阿帕替尼或反式－3－羥基阿帕替尼，反應60min。II相代謝孵化實驗：孵化介質為50mM Tris－HCl緩沖液（pH7.5），孵化體系包括：1 mg·mL－1的 HLM，2 mmol·L－1UDPGA，終濃度為50.0μmol·L－1的阿帕替尼、順式－3－羥基阿帕替尼或反式－3－羥基阿帕替尼，反應60min。

1.2.6 β－葡萄糖苷酸酶孵化水解試驗 取100μL合并血漿，加入2 000U·mL－1的β－葡萄糖苷酸酶溶液100μL，混合并于37℃水浴溫孵16 h。

3 結果

3.1 阿帕替尼色譜和質譜分析 阿帕替尼色譜保留時間為11.6 min。低碰撞能量下（圖1A），獲得［M＋H］＋離子為m／z 398.199（C24H24N5O＋）；高碰撞能量下，主要碎片離子有 m／z 371.190、m／z 212.081（相對豐度為100%）和m／z92.051等，推測質譜斷裂途徑見圖1B。斷裂主要發(fā)生在酰胺鍵、與吡啶相連的碳－氮鍵和氰基。本試驗將根據這些質譜斷裂特點，推測人血漿和尿樣中的代謝產物，通過與合成得到的對照品進行色譜、質譜對比，確定代謝物結構。

3.2 患者體內代謝產物鑒定 利用 Metabolynx軟件的 Mass Defect Filtering（MDF）和 Dealkylation功能對UPLC／Q－TOF MS數據進行處理，獲得血漿和尿樣中的代謝物譜（圖2）。與空白樣品相比，患者口服阿帕替尼后血漿和尿樣中共檢測到13種相關離子，分別命名為M0～M12，結合紫外檢測色譜圖（圖2），判斷患者體內的主要代謝產物。以代謝產物M1、M3和M9為例，闡述代謝產物的結構鑒定過程。

圖1 阿帕替尼對照品高碰撞能量全掃描質譜圖（A）及推測的質譜斷裂途徑（B）Fig 1 Mass spectra of the reference substance apatinib under high collision energy with positive detection mode（A）and proposed mass fragmentation pattern of apatinib（B）

圖2 UPLC－UV／Q－TOF MS檢測腫瘤患者口服阿帕替尼后血漿（A）和尿（B）的代謝物譜Fig 2 Combined UPLC－UV／Q－TOF MS chromatograms for the metabolites in patient plasma（A）and urine（B）

從低能量 MDF色譜圖中提取m／z 414.193（M0＋16 Da），在保留時間為8.2、7.9、8.7、8.8、10.3、11.1 min處檢測到6個色譜峰，分別命名為M1－1～M1－6。根據精確分子量推測比原形藥物增加一個O。在高碰撞能量下，M1－1～M1－4產生的主要碎片離子均為m／z 212.082，與原形相同，推測均為原形酰胺鍵的氨基部分羥基化產物。通過對比合成的羥基化對照品，確認 M1－1為順式－3－羥基阿帕替尼，M1－2為反式－3－羥基阿帕替尼。在高碰撞能量下，M1－5產生的主要碎片離子為m／z 228.074，比原形的碎片離子 m／z 212.081增加16 Da，推測M1－5為原形藥物酰胺鍵的?；糠至u基化產物。在高碰撞能量下，M1－6產生的主要碎片離子包括m／z397.188、228.074、212.089、108.048，其中m／z 228.074和m／z 108.048分別比原形藥物的碎片離子m／z212.081和92.051增加16 Da，m／z397.188比 M1－6的分子離子減少17 Da，為N－氧化物的特色碎片斷裂方式，m／z 212.089與原形藥物相同，推測M1－6為原形藥物在吡啶環(huán)N－氧化產物。

從低能量 MDF色譜圖中提取 m／z 323.151（M0－75 Da），在保留時間為6.3、6.7、7.2、7.4、9.8 min處檢測到5個色譜峰，分別命名為M3－1～M3－5。根據精確分子量推測比原形減少C6H5N并增加一個O。在高碰撞能量下，M3－1～M3－4產生的主要碎片離子均為m／z 121.043，比原形的主要碎片離子m／z 212.081減少C6H5N，即一個吡啶甲基。因此推測M3－1～M3－4是為原形藥物酰胺鍵的胺基部分羥基化并N－脫烷基產物。根據人肝微粒體I相代謝孵化結果，反式－3－羥基阿帕替尼孵化后生成 M3－1，順式－3－羥基阿帕替尼孵化后生成M3－2，因此確定 M3－1是反式－3－羥基阿帕替尼N－脫烷基產物，M3－2是順式－3－羥基阿帕替尼N－脫烷基產物。在高碰撞能量下，M3－5獲得碎片離子m／z 137.0356，比其他 M3的主要碎片離子m／z121.043增加16 Da，推測為原形藥物酰胺鍵的?；糠至u基化并N－脫烷基產物。

從低能量 MDF色譜圖中提取 m／z 590.225（M0＋196 Da），在保留時間為6.7 min和6.9 min處檢測到2個色譜峰，分別命名為M9－1和M9－2。根據精確分子量推測比原形增加C6H8O7。在高碰撞能量下，M9－1和M9－2產生的主要碎片離子均為 m／z 414.191、212.077和92.052。其中，m／z414.191與M1的分子離子相同且比分子離子m／z590.225減少176 Da（即一個葡萄糖醛酸分子），m／z212.077和m／z 92.052與原形藥物相同。因此，推測M9為原形藥物羥基化并葡萄糖醛酸結合代謝物。根據人肝微粒體II相代謝孵化結果，反式－3－羥基阿帕替尼孵化后生成 M9－1，順式－3－羥基阿帕替尼孵化后生成 M9－2。根據β－葡萄糖苷酸酶孵化水解實驗結果，M9的色譜峰在孵化后均消失，由于N－葡萄糖醛酸一般難以水解，推測M9的葡萄糖醛酸結合在羥基上。因此確定M9－1是反式－3－羥基阿帕替尼－O－葡萄糖醛酸結合物，M9－2是順式－3－羥基阿帕替尼－O－葡萄糖醛酸結合物。

3 討論

圖3 推測的阿帕替尼在腫瘤患者體內的代謝途徑Fig 3 Proposed metabolic pathways of apatinib in patients

表1 推測阿帕替尼在人血漿和尿中內代謝產物Tab 1 Identification of apatinib metabolites in human plasma and urine

續(xù)表1 推測阿帕替尼在人血漿和尿中內代謝產物Tab 1 Identification of apatinib metabolites in human plasma and urine

阿帕替尼口服給藥后在腫瘤患者體內廣泛代謝，在腫瘤患者體內共檢測到除原形外的49個代謝產物，包括40種I相代謝物及9種II相代謝物，其中血漿中有34個，尿中有43個，推測的代謝途徑見圖3，代謝產物離子的精確質量信息和元素組成見表1。主要代謝途徑為羥基化、N－脫烷基化、氧化脫氫、及葡萄糖醛酸結合。由紫外檢測色譜圖得知血漿中主要的代謝產物有順式－3－羥基阿帕替尼、順式－3－羥基阿帕替尼－O－葡萄糖醛酸結合物和反式－3－羥基阿帕替尼，尿中主要的代謝產物有順式－3－羥基阿帕替尼－O－葡萄糖醛酸結合物和雙羥基化代謝物。血漿中主要代謝物順式－3－羥基阿帕替尼及其O－葡萄糖醛酸結合物的濃度與原形藥物接近或更高，代謝產物的活性和安全性值得關注。

阿帕替尼在人體內羥基化表現出立體選擇性，選擇性生成更多的順式－3－羥基阿帕替尼（穩(wěn)態(tài)時順式－3－羥基阿帕替尼血漿濃度約為反式－3－羥基阿帕替尼濃度的3倍），而體外人肝微粒體孵化過程和化學合成過程均傾向生成更多的反式－3－羥基阿帕替尼。人體內代謝表現出與體外代謝和化學反應相反的立體選擇性原因需要進一步研究。

［1］Tian S，Quan HT，Xie CY，eta l.YN968D1is a novel and selective inhibitor of vascular endothelial growth factor receptor－2 tyrosine kinase with potent activity in vitro and in vivo［J］.Cancer Sci，2011，107（7）：1374－1380.

［2］Li J，Zhao XM，Chen L，eta l.Safety and pharmacokinetics of novel selective vascular endothelial growth factor receptor－2inhibitor YN968D1in patients with advanced malignancies［J］.BMC Cancer，2010，10：529－536.

［3］Zhu MS，Ma L，Zhang DL，et al.Detection and characterization of metabolites in biological matrices using mass defect filtering of liquid chromatography／high resolution mass spectrometry data［J］.Drug Metab Dispos，2006，34（10）：1722－1733.