參附注射液對腦缺血再灌注損傷大鼠GLUT1和GLUT3的影響

江承平，王柏強，劉福，李毅，楊明，周玥，吳碧華 （.川北醫學院附屬醫院藥劑科，四川 南充 637007；.川北醫學院神經病學研究所，四川 南充 637000）

參附注射液主要是由中藥人參、附片提取物組成，其主要有效成分分別是人參皂苷和烏頭類生物堿［1］，近年來大量研究表明，參附注射液對于腦缺血再灌注損傷有著明顯的療效，目前對其保護機制尚不完全明確。本試驗通過觀察參附注射液對腦缺血再灌注損傷后大鼠缺血半影區葡萄糖轉運蛋白1（GLUT1）及葡萄糖轉運蛋白3（GLUT3）表達的影響，探討其在腦缺血再灌注損傷的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料 PCR擴增儀（型號：PTC－150，MJ Research）；BDF－1600型雙穩電泳儀（北京東方儀器公司）；蛋白轉膜電泳槽及電泳儀（美國BIO－RAD公司）。參附注射液（雅安三九藥業，10mL／支，批號 991202）；Trizol試劑（GIBOC公司）；RT－PCR試劑盒（Promega公司）；內參照GAPDH 及GLUT1和GLUT3引物由廣州銳博生物公司合成；兔抗大鼠GLUT1和GLUT3抗體（一抗）購自Chemicon公司；羊抗兔抗體（二抗）購自北京中杉金橋公司；2，3，5－氯化三苯基四氮唑（TTC）購自Amresco公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及模型建立 健康雄性成年SD大鼠60只［SCXK（川2008－18）］，體質量210～250g（清潔級）由川北醫學院實驗動物中心提供。將大鼠分為4組：正常對照組（control組）、假手術組（sham組）、腦缺血再灌注組（IR組）、參附治療組（SFI組），每組15只。模型建立方法參照本實驗組前期試驗［2］，SFI組于手術前7 d每天經靜脈給參附注射液8 mg·kg－1，IR組與假手術組于手術前7天每天經靜脈給予生理鹽水（8 mg·kg－1），術前1 h完成最后一次注射，對照組不給予任何干預。所有大鼠于術前12 h給予禁食不禁水。采用線栓法經左側頸外－頸內動脈插線建立大鼠腦缺血再灌注損傷模型，腹腔注射麻醉后分離頸部各動脈，電凝切斷頸外動脈分支，將直徑0.25 mm線栓自右頸外動脈插入頸內動脈，至遇阻力為止，深度約為18 mm（自頸總動脈分叉處算起）結扎固定栓線，術中保存直腸溫度36.5～37.5℃。缺血2 h后，將尼龍線栓退至頸外動脈殘端恢復大腦中動脈血供，再灌注24 h，以大鼠蘇醒后出現左側Horner征，爬行向左側劃圈或左前肢屈曲作為模型建成的標志。對照組不給予任何操作，假手術組只進行麻醉與血管分離術，不進行缺血再灌注。

1.2.2 腦梗死面積測定 方法參照本試驗組前期試驗［2］，各組動物實驗結束，迅速斷頭取腦，置于－20℃冰箱中冷凍20min，距額極后2.5 mm，冠狀面切取腦片5張，將切片迅速置于2%TTC溶液中，避光，37℃ 溫孵15～30min，不時翻動腦片，使腦片均勻接觸染色劑，正常腦組織呈玫瑰紅色，梗死組織呈白色。然后置于4%多聚甲醛中固定，將染色結果輸入計算機，利用圖像處理軟件（Auto CAD），分別計算出5個腦片缺血側的總面積與梗死區域的面積，求出梗死區域占大腦半球總面積的百分比統計。

1.2.3 半定量逆轉錄－聚合酶鏈反應 缺血側大腦半球矢狀裂至外側裂區域下2／3的皮質由于該區皮質僅由大腦中動脈供血，缺血較重，梗塞出現早且完全，代表缺血中心區；上1／3區域的皮質由于由大腦前動脈和大腦中動脈雙重供血，該區域缺血相對較輕，代表缺血半影區。取缺血半影區皮層，Trizol試劑提取總RNA，GLUT1引物序列為：上游引物序列：5’– GCCTGAGACCAGTTGAAAGCAC –3’，下游引物序列：5’–CTGCTTAGGTAAAGTTACAGGAG–3’，預擴增片斷為292Bp；GLUT3引物序列為：上游引物序列：5’– ATGATAGGCCTGGGAGGCAT–3’，下游引物序列：5’– TCGAAAGTCCTGCCTTTGGT–3’，預擴增片斷為370Bp。β－actin引物序列為：上游引物序列：5’–TGTGATGGTGGGAATGGGTCAG－3’，下游引物序列：5’－TTTGATGTCACGCACGATTTCC－3’， 預擴增片斷為514Bp。循環條件：94℃變性1 min，56℃退火40s，72 ℃延伸30s，30個循環后，72 ℃再延伸10min，產物瓊脂糖凝膠電泳，照像，Kodark 1D電泳成像系統掃描分析。

1.2.4 蛋白印跡 取缺血半影區皮層少量組織置于1.5 mL的Ep管中，剪碎，勻漿器勻漿，加入裂解液，離心吸取上清液，測定蛋白質濃度采用Bradford法。各標本取等量蛋白質50μg，上樣，SDS－PAGE分離樣品，轉膜，封閉液室溫封閉后分別加入一抗與二抗，加入ECL試劑，暗室曝光，顯影，定影。以βactin為內參照，Kodark 1D電泳成像系統進行定量掃描分析，結果以β－actin校正。

1.3 統計學分析 實驗數據均經SPSS17.0統計軟件完成，結果以表示，正態性檢驗采用矩法，組間比較采用方差分析，方差不齊者采用非參數Kruskal Wallis檢驗，各組間兩兩比較采用q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 參附注射液對腦缺血再灌注大鼠腦梗死面積比的影響 TTC染色結果顯示，對照組和假手術組大鼠腦片均紅染，無白色梗死灶；IR組可見有明顯的梗死灶；SFI組與IR組比較腦梗死比顯著下降（P＜0.05），見表1。

2.2 GLUT1 mRNA和 GLUT3 mRNA檢測結果RT－PCR結果顯示，對照組和假手術組大鼠腦缺血半影區GLUT1 mRNA和GLUT3 mRNA表達水平明顯低于IR組和SFI組（P＜0.05）；SFI組明顯高于IR組（P＜0.05）；對照組和假手術組之間差異無統計學意義（P≥0.05），見圖1、表1。

2.3 GLUT1和GLUT3蛋白檢測結果 Western blots結果顯示，對照組和假手術組大鼠腦缺血半影區GLUT1和GLUT3蛋白的表達水平的明顯低于IR組和SFI組（P＜0.05）；SFI組明顯高于IR組（P＜0.05）；對照組和假手術組之間差異無統計學意義（P≥0.05），見圖2、表1。

表1 各組大鼠腦梗死面積比及半影區GLUT1、GLUT3 mRNA及蛋白的表達水平Tab 1 Infarction area ratio and expression of GLUT1 and GLUT3 in ischemia penumbra area

圖1 GLUT1和GLUT3 mRNA的表達M.Marker；A.對照組；B.假手術組；C.IR組；D.SFI組Fig 1 Expression of GLUT1 and GLUT3 mRNAM.Marker；A.control group；B.sham－operated group；C.IR group；D.SFI group

圖2 GLUT1和GLUT3蛋白的表達Fig 2 Expression of GLUT1 and GLUT3 protein

3 討論

生理狀態下，大腦不能儲備碳水化合物，腦功能維持所需要的能量幾乎完全依賴于不斷從血液中得到穩定的葡萄糖供應而產生的ATP，因此，將葡萄糖轉運至腦內的GLUT便成為維持腦代謝的重要物質。迄今為止，在哺乳動物的細胞中共發現13種GLUT。在腦內負責轉運葡萄糖的轉運蛋白主要是GLUT1和GLUT3［3］。GLUT1主要功能是將葡萄糖通過血腦屏障轉運到腦內［4］，GLUT3主要負責將葡萄糖穿過神經元細胞的胞膜進入細胞內［5］。

1994年 Hossmann［6］將缺血半暗區定義為：能量代謝保存但是血供受到抑制的區域，其主要位于缺血中心區的周圍。在我們的實驗動物模型中，缺血側大腦半球距離嗅球尖端7～11mm、矢狀裂至外側裂區域下2／3的皮質區域，由于此區域僅由大腦中動脈供血，梗死出現早并且完全，可以代表缺血中心區，上1／3的皮質區域由于由大腦前動脈和大腦中動脈雙重供血，缺血較輕，可代表半暗區。缺血半暗區的組織，具有雙向改變的可能，既可能通過改善腦血流量使半暗區的功能恢復，也可能由于腦血流量得不到改善進一步而發展為壞死。因此腦缺血的治療重點是可逆恢復缺血的腦組織［7］。腦缺血時，血腦屏障的通透性發生改變，葡萄糖的代謝需求增加［8－10］，GLUT的表達也發生了變化。Vannucci等［11］在研究幼鼠腦缺血缺氧模型中發現缺血后GLUT1mRNA 的表達明顯增加。Lee等［12］在實驗中發現，大鼠腦缺血再灌注后缺血半區GLUT3 mRNA表達迅速提高。我們在試驗中也得到相同的結果：大鼠腦缺血再灌注后缺血半暗區GLUT1和GLUT3 mRNA及蛋白水平明顯升高，這可能是機體對缺血缺氧的代償性保護機制，從而保證在缺血的狀態下有足夠的葡萄糖進入腦組織細胞從而維持正常細胞能量代謝減輕腦缺血損傷。

研究中我們還發現，參附注射液能夠顯著提高大鼠腦缺血再灌注損傷后GLUT1和GLUT3的表達，其具體機制尚不明確，GLUT1和GLUT3表達的增加，加快了葡萄糖通過血腦屏障向神經細胞的轉運，增加了神經元細胞的能量供應，通過對腦缺血再灌注后腦代謝的改善起到減輕腦缺血再灌注損傷的作用，這可能是參附注射液抗腦缺血再灌注損傷的作用機制之一。由于復方中藥制劑的作用機制復雜，參附注射液抗缺血再灌注損傷的作用可能還存在許多其他復雜的機制，還有待我們在以后進一步的研究和探討。

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