甘草5種方法提取液主要藥效學及急性毒性比較

程艷芹，王英姿，李明春 （.中國人民解放軍第40醫院，山東 青島 6607；.北京中醫藥大學藥學院，北京 000）

甘草是應用最為廣泛的中藥之一，素有“國老”之稱，具有補脾益氣，清熱解毒，祛痰止咳，緩急止痛，調和諸藥的功效［1］。我們前期對甘草用半仿生法（SBE）提取的工藝進行了優選［2］，為了考察SBE法對甘草的提取效果，對5種方法提取液［半仿生提?。⊿BE）、水提取（WE）、半仿生提取醇沉（SBAE）、水提醇沉（WAE）、醇提（AE）］作動物止咳、祛痰、抗炎、抗心律失常等藥效學及小鼠最大耐受量的比較研究，從而進一步驗證前期實驗選出的提取工藝的科學性和合理性。

1 材料

1.1 儀器 721－100型分光光度計（上海第三分析儀器廠）；MA110型電子分析天平（上海第二分析儀器廠）；ECG－6511心電圖機（上海光電醫用儀器有限公司）。

1.2 藥物與試劑 甘草飲片購自安徽滬譙中藥飲片廠，經山東中醫藥大學張兆旺教授鑒定，為豆科植物甘草Glycyrrhiza ralensis Fisch.的干燥根及根莖。25%氨水（批號010308，青島化學試劑廠）；枸櫞酸（批號990701，上海試劑一廠）；二甲苯（批號20031221，天津市廣成化學試劑有限公司）。

1.3 實驗動物 昆明種小鼠，體質量（20±2）g，雌雄各半，由山東中醫藥大學實驗動物中心提供（許可證號：SCXK（魯）20050015）。Wistar大鼠，體質量（180～220）g，（200～250）g，雌雄各半，由山東中醫藥大學實驗動物中心提供（許可證號：SCXK（魯）20050015）。豚鼠，體質量200～250g，雌雄各半，由山東中醫藥大學實驗動物中心提供（許可證號：SYXK（魯）2005043）。

2 方法與結果

2.1 溶液的配制

2.1.1 SBE液 稱取甘草飲片，常壓下用不同pH的水加熱回流提取3次（加水量分別依次為飲片重量的10、6、6倍；浸泡30min），3煎提取pH 值分別為6.0、7.5、9.0，提取時間依次為2、1、1 h。分別濾過，離心（3000r·min－1，25 min），濃縮至0.1 g·mL－1（生藥），即得。

2.1.2 WE液 方法同“2.1.1”項下方法，僅將三煎用水換成純化水。

2.1.3 SBAE液 取“2.1.1”項下的SBE液，加入乙醇，使含醇量達40%，靜置、冷藏，取上清液，回收乙醇，濃縮至0.1 g·mL－1，即得。

2.1.4 WAE 液 取 “2.1.2”項下的 WE 液，按“2.1.3”項下方法依法制備，即得。

2.1.5 AE液 方法同“2.1.1”項下，僅將提取溶媒改成50%的乙醇，回收乙醇，濃縮至0.1 g·mL－1，即得。

2.2 止咳作用［3，4］

2.2.1 小鼠濃氨水噴霧法 取小鼠60只，體質量18～22 g，雌雄各半，隨機均分成6組，即SBE、SBAE、WE、WAE、AE、純化水組。灌胃給藥（1.5 g·kg－1），對照組給等體積的純化水。每天1次，連續6 d，末次灌胃1 h后，將小鼠逐個放入玻璃鐘罩內，待其呼吸及活動正常后，通過空氣壓縮及連接玻璃噴頭將25%濃氨水均勻地噴入鐘罩內，噴霧5 s，動物繼續于鐘罩內滯留25 s后取出，放入倒置的大燒杯內，用秒表記錄小鼠咳嗽潛伏期（開始噴霧后動物在燒杯內第1次咳嗽出現的時間）及5 min內咳嗽的次數，以此比較各組提取液的止咳效果。用SPSS 12.0統計軟件作方差分析，比較組間均數，下同。

結果表明，5方法提取液均可使小鼠咳嗽潛伏期增加，咳嗽次數減少?？人詽摲?，與純化水組比較，SBE、WE、AE給藥組有非常顯著性差異（P＜0.01），SBAE、WAE有顯著性差異（P＜0.05）；SBE與WE、SBAE以及 WAE比較有顯著性差異（P＜0.05）?？人源螖担c純化水組比較，SBE、AE給藥組有非常顯著性差異（P＜0.01），SBAE、WE、WAE有顯著性差異（P＜0.05）；SBE與 WE、SBAE以及WAE比較有顯著性差異（P＜0.05）。見表1。

2.2.2 豚鼠枸櫞酸噴霧引咳法 選用體質量200～250g豚鼠，雌雄各半，置容積為2 L的密閉玻璃鐘罩內，噴入17.5%枸櫞酸溶液1 min，將噴霧后5 min內咳嗽次數少于10次者剔除。取合格者48只，隨機分為6組（同“2.2.1”項下），灌胃給藥（1.2 g·kg－1），每天1次，連續5 d，末次給藥后45 min將豚鼠置于玻璃鐘罩內，同上法噴入17.5%枸櫞酸溶液1 min，用秒表記錄豚鼠咳嗽潛伏期（噴霧開始至第1次咳嗽出現的時間）及5 min內咳嗽的次數。

(4)尾煤泥二段回收。二段濃縮設備的底流進入壓濾機，回收低熱值細尾煤泥，濾液清凈復用，并杜絕高灰粘土類礦物雜質惡性循環。

表1 5種方法提取液對小鼠咳嗽潛伏期（S）和5 min內咳嗽次數的影響（，n＝10）Tab 1 Effect of extracts picked up by the 5 methods on the latent period（S）and the frequency of cough of mice in 5 minutes（，n＝10）

表1 5種方法提取液對小鼠咳嗽潛伏期（S）和5 min內咳嗽次數的影響（，n＝10）Tab 1 Effect of extracts picked up by the 5 methods on the latent period（S）and the frequency of cough of mice in 5 minutes（，n＝10）

注：與純化水比較，aP＜0.05；bP＜0.01；與SBE組比較，cP＜0.05

內咳嗽次數純化水 — 11.2±3.94 19.9±5.組別 劑量／g·kg－1咳嗽潛伏期內咳嗽次數5 min51 SBE 1.5 26.5±6.52b9.2±4.78b WE 1.5 18.6±6.13bc14.6±4.48ac SBAE 1.5 17.3±4.44ac14.1±6.42ac WAE 1.5 16.6±4.16ac14.2±5.57ac AE 1.5 23.5±5.85b8.7±3.06b

結果表明，5組給藥組與純化水對照組比較，均可使豚鼠咳嗽潛伏期延長，咳嗽次數減少?？人詽摲?，與純化水組比較，SBE、AE給藥組有極顯著性差異（P＜0.01），WE、SBAE、WAE有顯著性差異（P＜0.05）；SBE與SBAE比較有顯著性差異（P＜0.05），與 WAE有極顯著性差異（P＜0.01）。咳嗽次數，與純化水組比較，SBE、WE、AE給藥組有極顯著性差異（P＜0.01），SBAE有顯著性差異（P＜0.05），WAE無顯著性差異（P＞0.05）；SBE 與SBAE比較有顯著性差異（P＜0.05），與 WAE有極顯著性差異（P＜0.01）。見表2。

表2 5種方法提取液對豚鼠咳嗽潛伏期（S）和5 min內咳嗽次數的影響（，n＝8）Tab 2 Effect of extracts picked up by the 5 methods on the latent period（S）and the frequency of cough of guinea pigs in5 minutes（，n＝8）

表2 5種方法提取液對豚鼠咳嗽潛伏期（S）和5 min內咳嗽次數的影響（，n＝8）Tab 2 Effect of extracts picked up by the 5 methods on the latent period（S）and the frequency of cough of guinea pigs in5 minutes（，n＝8）

注：與純化水比較，aP＜0.05；bP＜0.01；與SBE組比較，cP＜0.05；dP＜0.01

內咳嗽次數純化水 — 60.6±11.54 17.1±7.組別 劑量／g·kg－1咳嗽潛伏期內 5 min 02 SBE 1.2 136.2±41.61b6.6±3.11b WE 1.2 108.4±33.25a11.0±4.21b SBAE 1.2 92.3±26.45ac12.1±4.09ac WAE 1.2 94.1±24.53ad12.8±4.92d AE 1.2 135.9±27.18b7.5±1.93b

2.3 化痰作用［4，5］

2.3.1 小鼠氣管段酚紅法 取小鼠60只，體質量22～26 g，雌雄各半，隨機分為6組，分組及給藥方案同“2.2.1”項下方法。末次灌胃30min后，腹腔注射酚紅0.1 mL（0.5 mg·g－1），注射酚紅30min后，處死動物，剝離氣管周圍組織，剪下自甲狀軟骨下至氣管分支處氣管段，放入盛有2 mL純化水的試管中，再加入氫氧化鈉（1 mol·L－1）2滴，用分光光度計于546 nm處測吸光度值（OD值），以OD值為酚紅排泌量指標，以此評價5種提取液的祛痰結果。

結果表明，5種方法提取液均可使小鼠氣管段酚紅排泌量顯著增加。與純化水組比較，SBE、WE及AE有極顯著性差異（P＜0.01），SBAE、WAE有顯著性差異（P＜0.05）；SBE 與 WE、SBAE 及WAE比較有顯著性差異（P＜0.05），與AE比較無顯著性差異（P＞0.05）。見表3。

表3 5種方法提取液對小鼠氣管酚紅排泌量的影響（，n＝10）Tab 3 Effect of extracts picked up by the 5 methods on the amount of secreting phenol red in mice（，n＝10）

表3 5種方法提取液對小鼠氣管酚紅排泌量的影響（，n＝10）Tab 3 Effect of extracts picked up by the 5 methods on the amount of secreting phenol red in mice（，n＝10）

注：與純化水比較，aP＜0.05；bP＜0.01；與 SBE組比較，cP＜0.05；dP＜0.01

組別 劑量／g·kg－1OD值純化水 — 0.042±0.01 SBE 1.5 0.084±0.021b WE 1.5 0.063±0.013bc SBAE 1.5 0.058±0.018ac WAE 1.5 0.057±0.014ac AE 1.5 0.070±0.013b

2.3.2 大鼠排痰量——毛細玻管法 取大鼠60只，體質量200～250g，雌雄各半，隨機分為6組（同“2.2.1”項下），給藥組灌胃給藥（1.2 g·kg－1），每天1次，連續5 d，末次給藥后45 min，將動物用烏拉坦ip麻醉（1.0g·kg－1），仰臥固定，剪開頸部中皮膚，分離出氣管，在甲狀軟骨下緣正中兩軟骨之間插入直徑0.8 mm，長10cm毛細玻璃管，并開始計時，氣管內分泌物沿毛細管上升，測定2 h內玻管內痰液柱長度（cm）。

結果表明，5種方法提取液均可使大鼠排痰量增加，與純化水組比較，WAE有顯著性差異（P＜0.05），其余4組給藥組有極顯著性差異（P＜0.01），5組給藥組之間無顯著性差異（P＞0.05），見表4。

表4 5種方法提取液對大鼠排痰量的影響（，n＝10）Tab 4 Effect of extracts picked up by the 5 methods on the amount of dispelling phlegm in rats（，n＝10）

表4 5種方法提取液對大鼠排痰量的影響（，n＝10）Tab 4 Effect of extracts picked up by the 5 methods on the amount of dispelling phlegm in rats（，n＝10）

注：與純化水比較，aP＜0.05；bP＜0.01

cm純化水 — 0.53±0.組別 劑量／g·kg－1排痰量／19 SBE 1.2 1.08±0.32b WE 1.2 1.02±0.37b SBAE 1.2 0.94±0.34b WAE 1.2 0.83±0.29a AE 1.2 1.04±0.40b

2.4 對小鼠二甲苯性耳腫脹的影響［6－7］取小鼠60只，體質量18～22 g，隨機分為6組（同“2.3.1”項下）。給藥組分別灌胃（ig）給藥2.0g·kg－1，連續給藥4 d。末次給藥后45 min，于小鼠右耳正反面均勻涂抹二甲苯30μL／只，30min后脫頸椎處死，用8 mm打孔器在左右耳相同部位打下耳片，分析天平稱重。根據公式（1）、（2）分別計算腫脹度（mg）及腫脹抑制率（%）。

結果表明，5種方法提取液均可抑制二甲苯致小鼠耳腫脹，同純化水組比較，SBE、AE有極顯著性差異（P＜0.01），WE、SBAE、WAE有顯著性差異（P＜0.05）；SBE與SBAE、WAE比較有顯著性差異（P＜0.05）。AE的抑制率最高，其次是SBE，但二者比較無顯著性差異（P＞0.05）。見表5。

表5 5種方法提取液對小鼠二甲苯性耳腫脹的影響（，n＝10）Tab 5 Effect of extracts picked up by the 5 methods on the mouse ear edema induced by xylene（，n＝10）

表5 5種方法提取液對小鼠二甲苯性耳腫脹的影響（，n＝10）Tab 5 Effect of extracts picked up by the 5 methods on the mouse ear edema induced by xylene（，n＝10）

注：與純化水比較，aP＜0.05；bP＜0.01；與SBE組比較，cP＜0.05

組別 劑量／g·kg－1耳腫脹度／mg抑制率／%純化水組 — 0.018±0.600059 SBE 2.00.0088±0.0028b50.48 WE 2.00.0112±0.0025a37.03 SBAE 2.00.013±0.0045ac26.39 WAE 2.00.013±0.0051ac27.96 AE 2.00.007±0.0041b51.

2.5 對氯化鋇誘發大鼠心律失常持續時間的影響［8，9］取健康大鼠48只，體質量180～220g，隨機分為6組（同“2.2.1”項下）。各給藥組按1.2 g·kg－1灌胃給藥，空白組灌胃同體積的純化水，連用7 d。末次給藥30min后，腹腔注射10%水合氯醛（300mg·kg－1）麻醉，麻醉后仰臥位固定于恒溫手術臺上，將金屬針電極插入大鼠四肢末端皮下，并連接心電圖機。先描記正常Ⅱ導聯心電圖（EGG）后，由舌下靜脈注射0.4% 氯化鋇2 mg·kg－1誘發心律失常，10s內注射完畢，記錄心律失常持續時間。

結果表明，5種方法提取液均可使大鼠氯化鋇所致心律失常時間縮短。與純化水組比較，SBE及AE有極顯著性差異（P＜0.01），WE、SBAE 及WAE有顯著性差異（P＜0.05）。5組給藥組之間無顯著性差異（P＞0.05）。結果見表6。

表6 5種方法提取液對氯化鋇誘發大鼠心律失常持續時間的影響（，n＝8）Tab 6 Effect of extracts picked up by the 5 methods on the duration of rat arrhythmia induced by BaCl2（，n＝8）

表6 5種方法提取液對氯化鋇誘發大鼠心律失常持續時間的影響（，n＝8）Tab 6 Effect of extracts picked up by the 5 methods on the duration of rat arrhythmia induced by BaCl2（，n＝8）

注：與純化水比較，aP＜0.05；bP＜0.01

min純化水組 — 126.86±17.組別 劑量／g·kg－1持續時間／18 SBE 1.2 91.31±17.19b WE 1.2 97.75±10.14a SBAE 1.2 105.89±9.43a WAE 1.2 106.81±20.83a AE 1.2 94.92±18.64b

3 綜合評判

將“2.2～2.5”項下各藥理指標測定結果與該組純化水的測定結果相除，得R值，再求各組R值的均值ˉR，以ˉR作為綜合評判指標，大者為佳。結果ˉR值大小順序分別為。見表7。

4 毒性比較－MTD的測定

取健康昆明種小鼠120只，雌雄各半，體質量18～22 g，按性別、體質量隨機分為6組：SBE組、SBAE組、WE組、WAE組、AE組及對照組。按最大耐受量測定法，5種提取液的濃度均為1.5 g·mL－1。實驗前12 h禁食不禁水，第2天分別于9：00、12：00、17：00時，按60mL·kg－1體質量灌胃給藥3次，一日灌胃給藥的最大給藥量為90.0g（生藥）·kg－1，本品成人臨床擬用最大劑量為9 g（生藥）·d－1，相當于成人（60kg）每天用藥量（0.15 g·kg－1）的600倍。對照組灌胃等容量純化水。給藥后觀察7 d，小鼠無一死亡，動物外觀，行為活動，精神狀態均正常，其毛發、飲食、糞便、活動、及生長情況均未見異常。7 d后處死動物，解剖后肉眼觀察其心、肝、脾、肺、腎及胃腸道等主要器官，未見明顯病理形態學變化。由此推算該藥小鼠灌胃給藥最大藥量約為臨床人日用量的600倍。因此認為本品各種方法提取液的毒性很小。

5 討論

試驗結果表明，甘草5種方法提取液中，SBE液在止咳、祛痰、抗炎、抗心律失常等方面的藥理作用較SBAE及WAE顯著性提高（P＜0.05）。各藥理指標綜合測定結果ˉR以SBE組最大，表明甘草以SBE法提取，提取物的綜合藥效最好。

用二甲苯作為致炎因子的炎癥模型，是急性早期炎癥的常用模型之一。從試驗結果可以看出，5種方法提取液均對二甲苯所致耳腫脹急性炎癥模型具有明顯的抑制作用，且SBE、AE及WE組的作用比SBAE、WAE組更明顯。表明醇沉減少了藥效成分，從而影響藥效。

氯化鋇致大鼠心律失常動物模型為常用的心律失常動物模型，目前被廣泛應用于中藥藥理學的研究之中。氯化鋇能增加肌浦氏纖維Na＋內流，提高最大舒張期去極化速率，而誘發心律失常［10］。在本試驗中發現，各組在舌下注射氯化鋇后均立刻就有不同程度心律失常發生。因此，未做各組間的心律失常潛伏期的統計比較，只比較了各組間心律失常持續時間。

急性毒性試驗中，尚未發現甘草5種提取液有毒性反應，表明其在臨床應用常規劑量下是安全的。SBE、AE組的提取率雖高，但毒性與 WE、WAE、SBAE組無顯著性差別。文獻報道［11］，甘草長期使用，會導致水鈉潴留，因此有必要做亞急性毒理試驗或長毒試驗。

［1］中國藥典.一部［S］.2010：80－81.

［2］程艷芹，孫秀梅，張兆旺，等.均勻設計法優選甘草的半仿生提取工藝條件［J］.中藥材，2007，30（5）：598－601.

［3］俞騰飛，田向東，李仁，等.甘草黃酮、甘草浸膏及甘草次酸的鎮咳祛痰作用［J］.中成藥，1993，15（3）：32－33.

［4］畢云，熊麗娟，王友立，等.必止咳膠囊主要藥效學及急性毒性試驗研究［J］.云南中醫學院學報，2004，27（3）：22－25.

［5］鄒冬良.咳安顆粒的藥效學實驗［J］.中國醫院藥學雜志，2007，27（3）：311－312.

［6］曲曉梅，金鐘太，尚艷華，等.甘草水煎液抗炎作用的實驗研究［J］.實用藥物與臨床，2005，8（5）：14－16.

［7］包淑云，喻麗珍，于禧龍.棉花根醇提物與水提物的止咳祛痰抗炎作用研究［J］.天然產物研究與開發，2011，23：730－733.

［8］何建成，劉雄，安耀榮，等.心肌康抗心律失常作用的研究［J］.中國中醫藥科技，2003，10（1）：40.

［9］李冀，趙偉國，李勝志，等.桂枝甘草湯及其提取物組分抗心律失常作用的實驗研究［J］.中醫藥信息，2009，26（4）：41.

［10］陳奇.中藥藥理研究方法學［M］.北京：人民衛生出版社，1993：732－735.

［11］于輝，李春香，宮凌濤，等.甘草的藥理作用概述［J］.現代生物醫學進展，2006，6（4）：77－79.