四種抗肝癌中藥對雞胚絨毛尿囊膜血管生成的影響

孫悅文 梁 鋼 唐燕霞

廣西醫科大學，廣西南寧 530021

腫瘤的發生需要微小血管的增生與灌流提供營養，異常的血管生成是腫瘤的一個明顯特征，因此，如何抑制腫瘤血管生長已經成為抗腫瘤藥物研究的一個非常重要的方向[1]。目前已發現有多種中藥可通過增強VEGF的表達促進血管的生成[2]，同時也利用CAM模型發現了多種中草藥的抑制血管生成作用[3]。索拉菲尼可以通過上游抑制酪氨酸激酶受體VEGFR和PDGFR而達到抑制血管生成的作用[4]，破骨風性平，可祛風除濕，活血散瘀，消腫止痛[5]；天胡荽性涼，有小毒，利濕止咳，涼血止血[6]；土半夏性溫，味辛，有毒，燥濕化痰，和胃健脾，有抗凝血作用[7]；血黨性平，無毒，有活血調經，補血止血，利咽消腫的功效[8]。以上藥物均具有血液血管相關的功效，為分析其作用，本文以索拉菲尼為陽性藥，采用雞胚絨毛尿囊模型觀察藥物對血管生長作用的影響，探討藥物對血管生成的作用，研究藥物可能存在的酪氨酸蛋白激酶抑制作用的靶向性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 雞胚 共144枚，購自南寧市良鳳農牧有限責任公司。

1.1.2 藥物 破骨風、土半夏、血黨、天胡荽購自廣西桂林市騰龍堂藥業有限責任公司同心園藥店；上述中藥均經過廣西中藥研究所鑒定并確認。索拉菲尼購自拜耳公司，片劑，200 mg/片，批準文號 H20060296。

1.1.3 儀器與試劑 CO2培養箱（美國Thermo公司），倒置相差顯微鏡（日本OLYMPUS公司），Hfsafe 1200安全柜（香港熱力發展有限公司），LDZX-50FBS立式高壓滅菌器（上海申安醫療器械廠），乙醇（購自成都市科龍化工試劑廠）。

1.2 方法

1.2.1 藥材的提取

1.2.1.1 藥材的選擇、提取與萃取 醇提：將藥材泡在約5倍體積75%的乙醇溶液中，回流提取2 h，得到濾液；重復1次；合并兩次藥液，過濾，濃縮至浸膏，移入干凈的瓶中備用。

1.2.1.2 藥物的濃度配置 雞胚實驗：索拉菲尼配成25 mg/mL[9]，各藥物配成50 mg/mL，對半稀釋2次得到3個濃度，得到索拉菲尼濃度：25 mg/mL，12.5 mg/mL，6.25 mg/mL；四種中藥濃度：50 mg/mL，25 mg/mL，12.5 mg/mL。各藥物在安全柜中0.22 μm微孔濾膜過濾，保存于-4℃。

1.2.2 假氣室的制備及加藥

取7日齡雞胚隨機分為給藥組和空白組，每組9枚。75%酒精棉球擦洗兩遍消毒，雞蛋氣室向上，長托與蛋托呈 45℃，放入溫度（37.0±0.5）℃，相對濕度 60%的 CO2培養箱中孵育。第2天，于超凈工作臺在氣室上方蛋殼處敲破蛋殼，用眼科鑷開1.5 cm×1.5 cm窗口，暴露下方的卵殼內膜，將預先剪成直徑5mm的滅菌定性濾紙[10]圓片放在CAM上較少血管處，實驗組加入100 μL不同濃度藥物，空白對照組加入100 μL氯化鈉注射液。然后用滅菌的透明膠紙封閉卵殼開口，繼續放入培養箱中孵育[11]。

1.2.3 CAM標本的制作

加藥孵育 48 h 后，加入甲醇∶丙酮（1∶1）的固定液 1.5 mL，室溫下固定15 min，待CAM的血管完全凝固后，用眼科鑷去掉CAM平面以上的卵殼和卵殼膜，并用眼科剪以濾紙載體為中心，完整剪下CAM，置盛有蒸餾水的碟皿中，用眼科鑷舒展CAM，將其平鋪于載玻片上。陰干。在顯微鏡下（×40）觀察血管生長情況。血管計數記錄以載體為中心，半徑5 mm內的血管數。用倒置顯微鏡觀察出大、中、小血管的粗細，計數。根據血管直徑將血管分為三類：（1）＞0.2 mm為一級血管；②＞0.05 mm且＜0.2 mm為二級血管；（3）＜0.05 mm為三級血管。

1.2.4 統計學處理

用SPSS 13.0統計軟件進行數據處理。計量資料以（x±s）表示，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

與空白對照組相比，索拉菲尼組、破骨風組均能使雞胚的二、三級血管減少（P＜0.01），土半夏組，血黨組能抑制雞胚三級血管的生長（P＜0.01），并且其高劑量組也能夠抑制二級血管的生長（P＜0.01）。其中，索拉菲尼組對二三級血管的抑制呈現劑量依賴性 （高低劑量對比，P＜0.01），破骨風組對三級血管的抑制呈現劑量依賴性（高低劑量對比，P＜0.01），高劑量組對二級血管的抑制率與中低劑量差異有統計學意義（P＜0.01）；血黨組與土半夏組對三級血管的抑制也呈現劑量依賴性（P＜0.01）；天胡荽雖高劑量對三級血管生長有一定抑制作用但是抑制作用較弱。具體見表1。各藥物組對大血管的生長均有影響，因大血管數量少故不做統計學分析。

3 討論

血管生成是指從母血管發芽生成出新的微小血管，在實體瘤的生長和轉移過程中，微血管起著至關重要的作用[12]。因此，通過抑制腫瘤組織的新血管形成可以抑制腫瘤的生長、轉移。

在研究血管生成領域，CAM是一個比較成熟經典的模型。雞胚在孵育的第3~5天和第7~10天血管生長最為活躍，第12天以后血管漸漸開始萎縮，因此，8天~12天是藥物作用的最好時期[13]。

在本實驗中可以看到，各藥物組對一級血管的生長也有一定影響，各藥物均能減少一級血管的均數，其中以土半夏與破骨風作用最強。提示藥物對雞胚主血管的發生也有一定影響。

表1 不同藥物組對雞胚CAM血管生成的影響（x±s）

在本實驗中可以看到索拉菲尼與破骨風對血管有明顯的抑制作用，同時，土半夏組與血黨組亦表現出一定的抑制作用，提示其中可能含有能抑制血管生長的成分，并有可能通過與索拉菲尼同樣的信號傳導途徑實現這一抑制作用。

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