靛酚藍(lán)法測(cè)定海水、河口水中銨氮的“鹽效應(yīng)”及其消除

廈門(mén)大學(xué)環(huán)境與生態(tài)學(xué)院 黃 曉

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靛酚藍(lán)法測(cè)定海水、河口水中銨氮的“鹽效應(yīng)”及其消除

廈門(mén)大學(xué)環(huán)境與生態(tài)學(xué)院 黃 曉*

靛酚藍(lán)法是國(guó)際上測(cè)定海水、河口水中銨氮(NH4-N)最常用的方法之一，但“鹽效應(yīng)”問(wèn)題嚴(yán)重影響NH4-N測(cè)定的數(shù)據(jù)質(zhì)量，需要將反應(yīng)體系調(diào)整到最佳pH值，即：10.5。該文報(bào)道一種方法，依據(jù)樣品鹽度添加適量NaOH試劑來(lái)調(diào)節(jié)pH值到最佳，從而方便地解決靛酚藍(lán)法測(cè)定咸水中NH4-N的“鹽效應(yīng)”問(wèn)題，并通過(guò)真實(shí)樣品的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)證明該方法的確有效。在光程為5cm時(shí)，該方法的檢出限為0.03μmol/L，線性范圍為0.2～8μmol/L，真實(shí)樣品的加標(biāo)回收率為96.9%～108.8%。

銨氮 靛酚藍(lán)法 鹽效應(yīng) 鹽度校正 pH校正

1 概述

銨氮(NH4-N)在海洋氮循環(huán)中扮演著十分重要的角色。在海水養(yǎng)殖環(huán)境中，NH4-N很容易積累，是影響水產(chǎn)動(dòng)物健康和導(dǎo)致死亡的重要原因[1, 2]。NH4-N還是海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)的必測(cè)項(xiàng)目[3]。測(cè)定海水中NH4-N的方法主要有熒光法[4]、靛酚藍(lán)法[5, 6]和次溴酸鹽法[3]。熒光法主要用于開(kāi)闊大洋中nmol/L濃度水平NH4-N的測(cè)定，而靛酚藍(lán)法和次溴酸鹽法主要用于河口和近海NH4-N的測(cè)定。次溴酸鹽法為間接方法，測(cè)定結(jié)果中含有部分氨基酸[7, 8]，因而只能定性或半定量地說(shuō)明海洋環(huán)境狀況的一個(gè)方面。靛酚藍(lán)法則是測(cè)定NH4-N的特效方法，為科學(xué)界所認(rèn)可并得到最廣泛的應(yīng)用。然而靛酚藍(lán)法測(cè)定咸水中NH4-N卻受到“鹽效應(yīng)”的顯著影響[3, 6]，這使得在近海和河口水體中獲取高質(zhì)量的NH4-N數(shù)據(jù)并不容易[6]。研究表明，靛酚藍(lán)法測(cè)定咸水中NH4-N顯色體系的最佳pH值為10.5[5, 6, 9-11]，“鹽效應(yīng)”卻使反應(yīng)體系的pH值隨鹽度發(fā)生漂移[5]。本研究旨在報(bào)道一種根據(jù)樣品的鹽度將反應(yīng)體系調(diào)節(jié)至最佳pH值的方法，從而解決困擾靛酚藍(lán)法測(cè)定咸水中NH4-N時(shí)的“鹽效應(yīng)”或者說(shuō)pH值漂移問(wèn)題。

2 靛酚藍(lán)法的原理及其“鹽效應(yīng)”問(wèn)題

2.1 靛酚藍(lán)法原理

在堿性條件下，以亞硝基鐵氰化鈉(Na2[Fe(CN)5NO]·2H2O)為催化劑，NH3與次氯酸鹽(OCl-)和苯酚(C6H5OH)反應(yīng)生成藍(lán)色的靛酚藍(lán)。該反應(yīng)的原理如式(1)～(3)所示[9]：

研究表明，pH影響NH2Cl的生成及其穩(wěn)定性，NH2Cl在pH為10.5時(shí)有最大的穩(wěn)定常數(shù)[9]。此外，靛酚藍(lán)的形態(tài)也會(huì)隨著pH的變化而變化，當(dāng)堿性較強(qiáng)時(shí)，靛酚藍(lán)以藍(lán)色的堿式結(jié)構(gòu)為主；而當(dāng)堿性較弱時(shí)，則形成黃色的酸式結(jié)構(gòu)(式4)。靛酚藍(lán)法測(cè)定NH4-N的表觀摩爾吸光系數(shù)隨著pH的變化而變化，在pH為10.5左右有最大值[5, 6, 9-11]。因此，pH影響靛酚藍(lán)反應(yīng)的整個(gè)歷程，且該反應(yīng)測(cè)定NH4-N的最佳pH為10.5。

2.2 靛酚藍(lán)法測(cè)定NH4-N的“鹽效應(yīng)”及其與pH的關(guān)系

靛酚藍(lán)法在用于測(cè)定咸水中的NH4-N時(shí)，由于水樣的Mg2+在堿性條件下會(huì)產(chǎn)生沉淀，導(dǎo)致試樣混濁，因而給NH4-N測(cè)定帶來(lái)麻煩，這就是應(yīng)用靛酚藍(lán)法測(cè)定NH4-N時(shí)最初遇到的“鹽效應(yīng)”。為了克服該問(wèn)題，很多學(xué)者提出了不同的解決辦法[12-15]，其中應(yīng)用最廣泛的是加入檸檬酸三鈉(CIT3-)絡(luò)合Mg2+來(lái)防止其沉淀[13]。該方法雖然解決了試樣的沉淀問(wèn)題，但仍然不能完全消除“鹽效應(yīng)”。表觀上，在加入檸檬酸三鈉絡(luò)合Mg2+之后，靛酚藍(lán)顯色的程度仍與樣品的鹽度大小有密切關(guān)系，因而有人提出根據(jù)鹽度乘以一定的校正系數(shù)來(lái)消除鹽度的影響[3, 16]。為區(qū)別起見(jiàn)，本文稱(chēng)后者為“剩余鹽效應(yīng)”。

靛酚藍(lán)法的“剩余鹽效應(yīng)”并不是由離子強(qiáng)度造成的[11]，而是根源于體系的pH緩沖性能受到干擾[5, 17]。研究發(fā)現(xiàn)，海水中的Mg2+可與CIT3-反應(yīng)生成Mg(CIT)?，進(jìn)而與試樣中的OH?發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)[5]，即：

Mg(CIT)?+ OH??Mg(OH)(CIT)2?(5)

由于形成Mg(OH)(CIT)2?的反應(yīng)消耗了OH?，因而反應(yīng)體系的pH值發(fā)生不同程度的降低；又由于通常情況下淡水樣品的Mg2+濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于海水，所以，當(dāng)樣品的鹽度越大，Mg2+濃度就越高，式(5)所描述的化學(xué)緩沖體系對(duì)OH?的消耗也就越多，反應(yīng)體系的pH值降低也就越顯著。從硬度不大的普通淡水樣品到典型的海水樣品，體系的pH值可從10.5降低到9.8左右[5]。因此，靛酚藍(lán)法“剩余鹽效應(yīng)”問(wèn)題的實(shí)質(zhì)是，反應(yīng)體系的pH不足以使靛酚藍(lán)充分保持在堿式狀態(tài)(式(4))。

曾有人假設(shè)靛酚藍(lán)法測(cè)定咸水中NH4-N的表觀摩爾吸光系數(shù)與pH呈二次函數(shù)關(guān)系，提出通過(guò)校正公式將pH≠10.5情況下測(cè)定的吸光值校正到pH=10.5情況下的吸光值，以此來(lái)消除“剩余鹽效應(yīng)”[18]。然而我們發(fā)現(xiàn)，此類(lèi)校正公式并不符合式(1)～(4)所反映的平衡關(guān)系，而用所報(bào)道的pH校正公式得到的加標(biāo)回收率也通常遠(yuǎn)高于100%，因此通過(guò)pH校正公式消除“剩余鹽效應(yīng)”的方案并不可靠。

綜上所述，應(yīng)用靛酚藍(lán)法測(cè)定近海及河口水中銨氮，要想取得高質(zhì)量數(shù)據(jù)的關(guān)鍵之一，就在于反應(yīng)體系的pH要控制在10.5±0.1[5, 6, 9, 11]。

3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

3.1 儀器與試劑

分光光度計(jì)；

聚乙烯材質(zhì)的具塞刻度試管(本研究使用江蘇康健醫(yī)療用品有限公司生產(chǎn)的KJ325型離心管)；

脫氨高純水；

試劑R1——苯酚酒精溶液(100 g/L，以95%酒精為溶劑)；

試劑R2——檸檬酸三鈉水溶液(400 g/L)；

試劑R3——堿性二氯異氰酸鈉水溶液(10g/L二氯異氰酸鈉+36 g/L NaOH，分別溶解之后再混合定容)；

試劑R4——?dú)溲趸c水溶液(44 g/L)；

試劑R5——亞硝基鐵氰化鈉水溶液(5 g/L)；

NH4-N標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(水溶液10000μmol/L)；

精密pH計(jì)(可讀數(shù)至0.1mV)和奧立龍8102BN Ross復(fù)合電極；

pH值為4.01、7.00和10.01的NBS標(biāo)度pH緩沖液(Thermo Scientific公司生產(chǎn))。

3.2 實(shí)驗(yàn)方法

3.2.1工作曲線的配置

移取5 mL NH4-N標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(10000 μmol/L)，用新制的脫氨高純水定容至100 mL，配制成500 μmol/L的NH4-N標(biāo)準(zhǔn)使用液。分別移取0、0.1、1、2、4、6、8 mL標(biāo)準(zhǔn)使用液定容至100 mL，配成濃度為0、0.5、5、10、20、30、40mol/L的標(biāo)準(zhǔn)序列，參照3.2.2節(jié)的步驟顯色，測(cè)定吸光值(光程為1 cm比色皿)。以濃度(μmol/L)為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，制作工作曲線。對(duì)于NH4-N濃度較低的海水樣品，NH4-N工作曲線的濃度梯度為0、0.2、0.5、1、2、5 μmol/L，測(cè)定吸光值時(shí)換用光程為5 cm的比色皿。

3.2.2樣品測(cè)定

定量移取25 mL樣品，然后依次加入試劑R1、R2、R3各1mL，再按表1加入一定量的氫氧化鈉試劑(R4)，最后加入 1mL試劑R5。每次添加試劑都要充分混勻之后再加下一種試劑。加完試劑并混勻之后立即密封，置于25 ℃恒溫水浴中反應(yīng)2 h以上。在波長(zhǎng)640 nm處測(cè)定吸光值，代入工作曲線計(jì)算，再經(jīng)過(guò)體積校正，消除不同體積氫氧化鈉試劑R4的影響之后，即可得到樣品的NH4-N濃度。

表1 消除“剩余鹽效應(yīng)”所需要的44 g/L氫氧化鈉試劑(R4)的體積

3.2.3 pH檢驗(yàn)

鑒于靛酚藍(lán)顯色體系的pH對(duì)銨氮測(cè)定的質(zhì)量至關(guān)重要，樣品測(cè)定完畢之后需要復(fù)核最終的pH。由于顯色反應(yīng)是在25 ℃條件下進(jìn)行，所以，樣品及pH緩沖液均需恒溫至25 ℃。

4 結(jié)果與討論

4.1 工作曲線和空白

工作曲線和空白是控制數(shù)據(jù)質(zhì)量的重要依據(jù)，空白對(duì)于極易受到污染的NH4-N樣品尤為重要。為了保證數(shù)據(jù)質(zhì)量，每批樣品測(cè)定之前都必須檢驗(yàn)工作曲線。正常情況下，多條工作曲線斜率的差別應(yīng)在3%~5%以?xún)?nèi)。本實(shí)驗(yàn)室工作曲線斜率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.55%，低于3%~5%，詳見(jiàn)表2。每次測(cè)樣之前還應(yīng)進(jìn)行空白實(shí)驗(yàn)，以檢測(cè)試劑和周?chē)h(huán)境的污染情況。如果空白值偏高，則必須把空白值降低到正常值，且穩(wěn)定之后方可測(cè)樣。一般對(duì)于5 cm的比色皿，典型空白值在0.090~0.110之間。本實(shí)驗(yàn)室采用5 cm比色皿，以靛酚藍(lán)法測(cè)定NH4-N的方法檢出限為0.03 μmol/L，線性范圍為0.2~8 μmol/L。較高濃度水樣應(yīng)改用1 cm的比色皿，或者用無(wú)氨水適當(dāng)稀釋之后再測(cè)定。

表2 工作曲線的重現(xiàn)性

4.2 真實(shí)樣品的加標(biāo)回收率

表3顯示，對(duì)于珠江口、黃河口和南黃海鹽度為9.5~33.0的水樣，按照表1的方案添加NaOH試劑R4，總可以使最終pH控制在10.51~10.57的理想范圍。將水樣的NH4-N濃度加標(biāo)到10~20 μmol/L，測(cè)定回收率為96.9%~108.8%，這表明，本方法得到的數(shù)據(jù)質(zhì)量可靠。

表3 河口與近海水中NH4-N的加標(biāo)回收率

4.3 與加入掩蔽劑方法的比較

最近，張衛(wèi)宏等報(bào)道了通過(guò)加入掩蔽劑(EDTA和酒石酸鉀鈉)來(lái)消除靛酚藍(lán)法“鹽效應(yīng)”的方法[19]。但作者報(bào)道的加標(biāo)回收率偏高(111.5%~115.0%)，均超過(guò)110%。由于作者未報(bào)道空白值，所以難以判斷其加標(biāo)回收率偏高是否由方法本身的空白值異常導(dǎo)致。而作者采用流動(dòng)注射分析方法，每分鐘測(cè)定1個(gè)樣品，頻率過(guò)高，通常來(lái)不及將管路清洗干凈，這也可能導(dǎo)致樣品之間的交叉污染，從而使得測(cè)值和加標(biāo)回收率偏高。

本研究所采用的方法不存在樣品之間交叉污染的問(wèn)題，在杜絕環(huán)境沾污的基礎(chǔ)上，空白值也相當(dāng)穩(wěn)定，因此，本研究加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)的結(jié)果更加理想（表3）。

5 結(jié)論

獲得海水、河口水中的高質(zhì)量NH4-N數(shù)據(jù)是有相當(dāng)難度的，除了從樣品采集、處理、保存、運(yùn)輸、試劑準(zhǔn)備和測(cè)定的各個(gè)環(huán)節(jié)入手以確保樣品不被污染以外，還必須調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH值到10.5±0.1范圍內(nèi)。本文報(bào)道了一種方法，根據(jù)樣品的鹽度加入適量NaOH試劑(見(jiàn)表1)，從而將反應(yīng)體系調(diào)節(jié)至最佳pH值，適用于河口和近海NH4-N的高精度測(cè)定。與加掩蔽劑的方法相比，本方法的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果更為理想。通過(guò)本方法測(cè)定NH4-N，要先通過(guò)CTD或者便攜式鹽度計(jì)獲得樣品鹽度，以便計(jì)算所需要NaOH試劑的添加量(見(jiàn)表1)。

對(duì)于我國(guó)大多數(shù)河口、近海海水體系，淡水端水體的Mg2+濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于海水[20]，因此，本研究提出的優(yōu)化方案基本解決了靛酚藍(lán)法測(cè)定河口、近海NH4-N時(shí)，反應(yīng)體系的pH難以達(dá)到最佳條件的問(wèn)題。不過(guò)，由于不同水系的地球化學(xué)性質(zhì)千差萬(wàn)別，為了穩(wěn)妥起見(jiàn)，建議針對(duì)所研究的區(qū)域檢驗(yàn)上述補(bǔ)充添加NaOH試劑的方案，或自行摸索通過(guò)調(diào)節(jié)pH來(lái)解決靛酚藍(lán)法“剩余鹽效應(yīng)”的具體實(shí)施方案。

致謝：

感謝王麗芳、翟惟東提供樣品，并參加討論。

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黃曉。