血清對大鼠角膜感覺神經損傷修復的影響

唐麗穎 張謀鑫 鄭明城 顏玉緣 陳 煒 謝茂松

血清對大鼠角膜感覺神經損傷修復的影響

唐麗穎1張謀鑫1鄭明城1顏玉緣1陳 煒1謝茂松2

1.福建醫科大學臨床醫學眼視光學系 2.福建醫科大學附屬第一醫院眼科

目的：探討血清對大鼠角膜感覺神經損傷修復的影響。方法：SD大鼠40只隨機分為兩組：實驗組和對照組，每組各20只。選取大鼠右眼制作大鼠角膜神經損傷模型，實驗組和對照組于損傷后分別用大鼠血清和生理鹽水點眼，每日3次。分別于造模后2d、4d、7d、9d、11d、14d、28d采用自制角膜知覺測定計測量麻醉后大鼠雙眼的角膜知覺，分別于造模后7d、14d、28d采用ELISA法檢測大鼠角膜乙酰膽堿含量。結果：對照組2天、4天、7天的作用力均明顯高于實驗組，說明血清有促進角膜神經損傷修復的作用，但組間差異只有第7天的具有統計學意義（=-2.459，=0.028）。實驗組大鼠角膜知覺差不多在受傷后7天就基本恢復，對照組差不多在9～14天才恢復。對照組7天、14天的角膜乙酰膽堿含量低于實驗組，但組間差異只有第7天的具有統計學意義（=2.684，=0.028）。結論：血清可促進大鼠角膜感覺神經損傷修復。

大鼠 血清 角膜感覺神經損傷 乙酰膽堿

角膜含有豐富的感覺神經纖維，當有異物接觸角膜時，眼瞼便會不由自主地合上以保護眼睛。若角膜神經損傷，就會大大減少角膜對外物接觸的敏感性，使角膜容易受損，引起角膜炎、角膜混濁、角膜潰瘍、角膜穿孔甚至喪失眼球等嚴重后果。角膜神經損傷在臨床上十分多見，但目前臨床上尚無可促進角膜神經損傷后再生藥物，本實驗通過制作大鼠角膜神經損傷模型來探討血清治療大鼠角膜神經損傷的療效。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

健康雄性8周齡SD大鼠40只，體重約250±20g，購自福建醫科大學實驗動物科學部，按隨機數字表隨機分為對照組（20只）和實驗組（20只）。

1.2 方法

1.2.1大鼠角膜神經損傷動物模型建立

大鼠用速眠新（吉林省華牧動物保健品有限公司）麻醉，在顯微鏡下用直徑為3mm的帶芯角膜環鉆在角膜中心鉆取一直徑為3mm、深度為0.5mm的環行切口，注意避免損傷其下的后彈力層和內皮層，即制成大鼠角膜神經損傷動物模型。采用角膜熒光素染色顯示損傷的區域，眼前節分析系統照相并分析損傷區域的大小。

1.2.2大鼠角膜神經損傷后的治療

大鼠角膜神經損傷實驗組采用大鼠血清滴眼（大鼠血清制備：大鼠股動脈抽血1mL，靜置30min后釋出血清，1000轉/分離心10min，取上清血清用于滴眼），每日3次；對照組用生理鹽水滴眼，每日3次。

1.2.3角膜知覺測定

造模后2d、4d、7d、9d、11d、14d、28d采用自制的尼龍絲角膜知覺測定計測量大鼠麻醉后的角膜知覺。將角膜知覺測定計的尼龍絲從150mm開始輕輕觸及受檢眼的角膜中央。角膜知覺正常者，尼龍絲彎曲并可立即出現反射性瞬目或有感知。若不發生瞬目反射或無感知，為角膜知覺消失。如瞬目反射遲鈍或感知不敏感，將尼龍絲從150mm依次逐量（間隔10mm）減少直至10mm，通過標準曲線計算出尼龍絲的作用力，以作用力的大小來反映大鼠角膜知覺敏感度，記錄結果。角膜知覺測定計標準曲線測定：尼龍絲從150mm依次逐量（間隔10mm）減少直至10mm，將尼龍絲輕觸分析天平，測出不同長度尼龍絲彎曲所需的力，以長度為橫坐標，作用力為縱坐標，繪制標準曲線。

1.2.4大鼠角膜乙酰膽堿含量檢測

采用ER-1419大鼠乙酰膽堿Elisa試劑盒（上海江萊生物科技有限公司）檢測大鼠角膜乙酰膽堿含量，取大鼠角膜中央直徑為3mm角膜片（原角膜神經損傷區），加入稀釋液150μL，勻漿，轉速為1000轉/min，時間為10分鐘。高速離心后取50μL加入待測樣品孔，37℃反應120分鐘。每孔加檢測溶液A工作液50μL，37℃反應60分鐘后，再每孔加檢測溶液B工作液（同檢測A工作液）50μL，酶標板加上覆膜37℃反應60分鐘。溫育60分鐘后，棄去孔內液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1～2分鐘，150μL/每孔，甩干，依序每孔加底物溶液90μL和終止溶液50μL，而后立即用酶聯儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。

1.2.5統計學方法

2 結果

2.1 大鼠角膜知覺敏感度

對照組2天、4天、7天的作用力均明顯高于實驗組，但組間差異只有第7天的統計學意義，結果見表1。實驗組角膜知覺差不多在受傷后7天就基本恢復，而對照組角膜知覺差不多在9～14天才恢復。

表1 大鼠角膜知覺測定（N）

2.2 大鼠角膜乙酰膽堿含量

對照組7天、14天的角膜乙酰膽堿含量低于實驗組，但組間差異只有第7天的具有統計學意義，結果見表2。

表2 大鼠角膜角膜乙酰膽堿含量（g/mol）

3 討論

角膜知覺檢查方法不斷改進,Boberg-Ans[1]將尼龍線至于一個套管內，其游離端的長度和曲度均可改變，垂直眼在角膜表面，直至引起反應為止，經校正后即可了解作用的力。本實驗模擬以上的測量方法，分別采用1～15cm（14.523g～0.0268g）的尼龍絲測量實驗組和對照組大鼠的角膜知覺，測量結果為：對照組2天、4天、7天的作用力均明顯高于實驗組，但組間差異只有第7天的統計學意義。由第七天數據得知測量引起角膜知覺的平均力量為6.8mg。考慮為大鼠血清中的神經生長因子可促進角膜神經損傷修復，進而引起角膜知覺的提高。

角膜無色透明，無血管、淋巴管，有豐富的神經纖維支配。其中大多數是副交感神經的膽堿能神經支配[6]。本實驗通過Elisa檢測對照組和實驗組大鼠經過7天、14天、28天后角膜中乙酰膽堿的含量而推測角膜神經修復的程度，7天測量結果的差異具有統計學意義。考慮實驗組的神經損傷修復速度明顯大于對照組，即實驗組的角膜勻漿中乙酰膽堿的濃度較大。通過該方法研究角膜知覺損傷修復效果的文獻不多。

知覺是角膜重要的功能之一，具有保護眼前部的作用。角膜營養依賴于完整的感覺神經支配，角膜的神經支配非常豐富，感覺十分敏銳，損傷可致神經營養性角膜病，引起持續性角膜上皮損傷[2]。血清的生物力學和生物化學特性與正常淚液相同，其可向眼表提供上皮修復所需的基本營養物質血清中含有豐富的細胞生長因子，如表皮生長因子( EGF)、轉移生長因子( TGF) 、成纖維細胞生長因子( FGF) 、神經生長因子( NGF) 等，纖維連接蛋白( FN)，維生素A 和E 這些營養物質可以促進眼表上皮的再生和修復，防止角膜潰瘍穿孔的發生[3]。其中，神經生長因子（NGF）是一種強的促細胞分裂因子，能促進神經細胞及多種非神經元性細胞的增生和分化。自體血清還含有大量氨基酸、核酸關聯物質, 可以改善組織營養, 刺激細胞再生, 加速組織修復[4]。這些表明自體血清可以成為一種很好的淚液替代物, 向眼表修復提供必要的營養物質。

關于角膜知覺研究，Cocher和Bonnet[5]對Boberg-Ans法進行了改進，證實角膜中央閾值平均為10mg，周邊為18mg。本實驗與之相比數據偏低，可能因素有尼龍絲的材質、麻醉的深度、偶可對角膜上皮產生損傷等。

綜上所述，自體血清具有來源取材方便、制作簡單、經濟、并發癥少等特點, 滴眼治療促進角膜神經損傷的修復和縮短療程。因此, 自體血清是一種理想的治療方法。

[1] Boberg-Ans J. Experience in clinic al examination of corneal sensitivity: comeal sensitivity and the naso-lacrimal reflex after retrobulbar anaesthesia[J]. Br J Ophthalmol, 1955, 39（12）: 705-726.

[2] Okada Y, Reinach PS, Kitano A, et al. Neurotrophic keratopathy: its pathophysiology and treatment[J]. Histol Histopathol, 2010,25（6）: 771-780.

[3] 周媛，鄒新蓉.自體血清治療持續性角膜上皮缺損的臨床分析[J]. 眼外傷職業眼病雜志, 2010,32（12）：888-890.

[4] 曲忻,郝繼龍.自體血清聯合糖皮質激素局部應用治療非感染性角膜潰瘍[J]. 中國實用眼科雜志, 2006, 2 ( 3) : 341-342.

[5] 季迅達，朱浩浩，李洪，2型糖尿病角膜知覺減退及其與眼表異常的相關性研究[J]. 眼視光學雜志, 2007，9(2): 97-99.

[6] 郝旖旎，畢燕龍.角膜感覺神經及其損傷的研究發展[J]. Int Rev Ophthalmol, 2011,35(5):307-311.